Патент на изобретение №2379070

(54) СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ДИСТРОФИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и биологии. Область опухоли облучают низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 475 нм по 15 минут за сеанс общим курсом 14 ежедневных сеансов. Способ позволяет вызвать кариорексис и кариопикноз ядер опухолевых клеток.

Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии и демонстрирует возможность индуцирования низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 475 нм дистрофических изменений в виде кариорексиса в клетках опухолевой ткани.

Поиск новых способов воздействия на опухолевую ткань, способных вызвать ее деструкцию, является актуальной задачей современной экспериментальной онкологии. Кариорексис – это процесс распада клеточного ядра на части; один из этапов некробиоза, предшествующего гибели клетки. При кариорексисе происходит разрушение ядерной оболочки и выход нуклеиновых кислот в виде отдельных глыбок в цитоплазму. Таким образом, кариорексис представляет собой критерий для оценки дистрофических изменений в клетках, в связи с чем его стимулирование может считаться показателем повреждающего действия исследуемого излучения на опухоль.

В работе [26] кариорексис приводится в качестве показателя повреждающего действия на опухолевую ткань выделенных из нейросекреторных гранул гипоталамуса пролин-богатых полипептидов, которое для зрелых опухолевых клеток происходит путем фрагментации ядра и цитоплазмы, а для незрелых путем внезапного разрушения ядер (кариопикноз, кариорексис и кариолизис).

В работе [27] при исследовании дистрофических изменений в опухолевой ткани рассматривалась в качестве критерия оценки противоопухолевая эффективность препарата ЭВР-А на мышах линии BALB/C (штамм аденокарциномы тонкого кишечника). Было показано, что состояние хроматина опухолевых клеток опытной группы свидетельствует о дистрофических и дегенеративных изменениях в ядрах, приводящих к их гибели и лизису. Дистрофические и дегенеративные изменения наблюдались также и в цитоплазме: множественные разной величины очаги некроза, в которых содержится большое количество лейкоцитов и макрофагов.

В экспериментах на мышах гибридах F₁ (СВА+С₅₇|В₆) с перевитой внутрибрюшинно эмбриокарциномой были оценены характер морфологических изменений в опухолевых клетках и продолжительность жизни животных в опытной и контрольной группах. Животным опытной группы на 7-е сутки роста опухоли (в терминальной стадии опухолевого процесса) вводили хлорин-е6 внутрибрюшинно и облучали лазерным излучением (662 нм). В результате было показано, что через 24 часа в опухолевом материале наблюдаются явления «осмоса», деструкция опухолевых клеток, разрушение ядер и клетки с рыхлым хроматином. Через 48 часов увеличивается количество лимфоидных клеток и перитонеальных макрофагов, наблюдается значительное количество дегенеративно измененных и разрушенных опухолевых клеток, набухание цитоплазмы и разрушение хроматина [25].

Однако все способы стимулирования дистрофических изменений в опухоли сопряжены с введением в организм каких-либо фармацевтических агентов, впоследствии воздействующих на опухоль. Использование фармацевтических агентов, как правило, ограничено, так как связано с побочными эффектами, аллергическими реакциями, противопоказаниями и т.п.

В задачу предлагаемого изобретения было положено расширение арсенала действующих средств и разработка нового метода, способного оказать повреждающее воздействие на опухолевую ткань без использования фармацевтических средств.

В качестве действующего фактора исследовалось низкоинтенсивное лазерное излучение (далее НИЛИ) с длиной волны 475 нм, что соответствует диапазону синего света.

В медико-биологической практике облучение синим светом в настоящее время имеет широкий спектр разнообразных точек приложения. Однако данных о влиянии НИЛИ в диапазоне синего света на опухолевый рост в доступной литературе не обнаружено.

А.С.Крюк с соавторами [19] оценил стимулирующую эффективность низкоинтенсивного лазерного излучения различных длин волн в видимой области спектра, проводя сравнение действия света гелий-неонового (632,8 нм – красный) и гелий-кадмиевого (441,6 нм – синий) лазеров. Была показана высокая биологическая активность излучения гелий-кадмиевого лазера, а также повышение терапевтической активности при последовательном применении лазеров красного и синего диапазонов.

Диасамидзе Ю.С. [10] предложил облучать кровь синим светом для лечения больных с ишемической болезнью сердца, при этом было установлено снижение концентрации в крови липопротеинов низкой плотности.

На основе использования синего света светодиодов разработан способ лечения депрессии, заключающийся в воздействии на человека некогерентным оптическим излучением в видимом диапазоне по 30 минут в утренние часы в течение 10 дней [24].

Гаспарян Л.В. сообщил об опыте применения внутривенного облучения крови синим светом при лечении нейросенсорной тугоухости, облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей, гнойно-воспалительных процессов, хронических простатитов с весьма обнадеживающими клинико-лабораторными результатами [6]. В дальнейших работах были приведены данные влияния светодиодного излучения синего цвета на функциональную активность тромбоцитов [7].

В.И.Карандашов с соавторами [13, 14, 15, 16, 17] исследовал влияние экстракорпорального облучения крови синим светом на свертывающую систему крови, биологические, иммунологические, клинические показатели у больных с ишемической болезнью сердца, облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей [18], нарушением мозгового кровообращения, бронхиальной астмой [12], хроническим обструктивным бронхитом. Облучение крови синим светом оказалось эффективным методом для нормализации реологических показателей крови [2, 3].

Идея применения НИЛИ в качестве монотерапии для облучения опухолей (неспецифическая сторона воздействия – торможение опухолевого процесса, вплоть до его подавления) основывается на «увеличении тучных клеток в ретикулярном слое дермы: если учесть, что тучные клетки являются конкурентами, то есть захватывают из межклеточной среды полисахариды, необходимые для других клеточных элементов, в том числе и опухолевых клеток, становится ясной перспектива использования облучения лазерной энергией опухолевых образований с целью приостановки их роста» [20].

Практическое использование монохроматического лазерного света в экспериментальной онкологии ограничено отсутствием сведений, четко определяющих механизмы действия света, эффективных длин волн и режимов облучения.

В экспериментах на крысах с лимфосаркомой Плисса при облучении лазером с длиной волны 510 нм было получено торможение метастазирования, однако существенного влияния на рост опухоли это излучение не оказывало [11].

В результате экспериментов на белых крысах-самцах с перевитой саркомой-45 установлено, что облучение опухоли НИЛИ гелий-неонового лазера (длина волны 630 нм, время экспозиции 10 минут в течение 22 дней, начиная с первого дня после перевивки) стабилизирует течение опухолевого процесса, а в ряде случаев ведет к его ингибированию: животные контрольной группы погибали в течение 28-40 дней, тогда как в опытной группе они жили до 80 дней [9].

Отмечается, что многократное облучение области перевивки опухоли НИЛИ УФ-эксимерного лазера (длина волны 308 нм) вызывает торможение развития лимфосаркомы Плисса. При этом авторы указывают на то, что облучение опухоли гелий-неоновым лазером (длина волны 633 нм) приводит к стимуляции опухолевого роста [4].

Таким образом, данных о влиянии НИЛИ в диапазоне синего света на опухолевый рост в доступной литературе не обнаружено.

В задачу предлагаемого изобретения положена индукция дистрофических изменений в опухолевой ткани штамма лимфосаркома Плисса.

Поставленная задача достигается тем, что область растущей опухоли, начиная со второго дня после ее трансплантации экспериментальным животным, облучается НИЛИ в диапазоне длин волн от 420 нм до 490 нм (475 нм) по 15 минут в количестве 1 сеанса ежедневно общим курсов 14 сеансов. Забор образцов опухолевой ткани для морфометрических исследований осуществлялся на 14 день роста опухоли. Таким образом, общий курс составляет 14 сеансов облучения общей продолжительностью 210 минут.

Лимфосаркома (ЛФС) Плисса – экспериментальная опухоль, полученная в 1958 году после подкожной перевивки опухоли, возникшей у крысы, получавшей 3,3-дихлорбензидин [21]. Штамм ЛФС, приобретенный в НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г.Москва), пассировался на крысах в возрасте 3 месяцев. Опухоль брали для инокуляции крысе-реципиенту на 14 день развития. Взвесь опухолевых клеток в физиологическом растворе объемом 0,5 мл вводили подкожно в область правого бедра.

Согласно экспериментальным данным В.А.Горькова и Л.С.Васильевой (1973) кинетика развития ЛФС Плисса имеет следующие стадии роста: начальная нестационарная фаза начинается латентным периодом до 3 суток, и продолжается до 9 суток; затем идет линейная фаза роста опухоли [8]. Таким образом, начало воздействия НИЛИ с длиной волны 475 нм на опухоль совпадало с начальной фазой роста ЛФС Плисса, а забор опухолевой ткани для гистологического исследования производился на поздней стадии роста ЛФС Плисса.

Продолжительность воздействия 15 минут была определена эмпирическим путем и основывалась на данных предварительных экспериментов in vitro, в которых было показано, что облучение образцов биологических жидкостей ВИЛИ в течение 15 минут приводит к максимальному повышению в них значений свободно-радикального окисления (проведены эксперименты со следующими продолжительностями облучения НИЛИ: 1,5, 10, 15, 20, 25 и 30 минут).

Для проведения исследования экспериментальные животные были распределены на следующие группы:

1 группа – контрольная (7 крыс с ЛФС без воздействия) – животным была привита ЛФС Плисса, однако облучению НИЛИ с длиной волны 475 нм впоследствии они не подвергались и содержались в стандартных условиях. Срок роста опухоли к моменту декапитации и забору образцов опухолевой ткани составлял 14 дней.

2 группа – экспериментальная (7 крыс с ЛФС + НИЛИ) – животные с ЛФС Плисса. На следующий день после прививки опухоль начинали облучать непрерывным низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 475 нм в количестве одного ежедневного сеанса продолжительностью 15 минут. На момент эвтаназии под эфирным наркозом срок роста опухоли составлял 14 дней.

Образцы опухолевой ткани для гистологического исследования фиксировали в 10% забуференном водном растворе нейтрального формалина, проводили по спиртам восходящей крепости и двум порциям хлороформа, а затем заливали в парафин. Приготовленные срезы толщиной 6 мкм, полученные с помощью санного микротома, после депарафинизации окрашивали гематоксилином и эозином [5, 1]. Подсчет опухолевых клеток с помощью бинокулярного микроскопа с увеличением 600х (объектив – 40, окуляр – 15) проводился по стандартной методике с использованием сетки С.Б.Стефанова [23].

В препаратах опухолевой ткани на площади, ограниченной сеткой, подсчитывали общее количество клеток опухоли, количество активных клеток и погибающих клеток опухоли [22]. К погибающим клеткам относили клетки с лизирующимися ядрами, а также в состоянии пикноза и кариорексиса [21].

В результате исследования препаратов опухолевой ткани животных контрольной группы методом световой микроскопии было установлено, что опухоль состоит из клеток округлой формы, большая часть которых занята крупным ядром. Хроматин располагается главным образом в периферической зоне ядра. Ядрышки крупные, гиперхромные. Цитоплазма опухолевых клеток отличается умеренной базофилией. Опухоль обладает выраженным инфильтративным ростом в мышечные слои и подкожно-жировую клетчатку. В строме опухоли отмечается полнокровие, отек, кровоизлияния. В различных участках опухолевой ткани имеются зоны спонтанной некротизации, наблюдаются дистрофические изменения отдельных клеток.

Морфологическое исследование опухолевой ткани, подверженной действию низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 475 нм, выявило значительные дистрофические изменения клеток опухоли: особенностью действия низкоинтенсивного лазерного излучения на опухолевую ткань являются морфологические изменения ядер в опухолевых клетках преимущественно в виде кариорексиса, реже в виде кариопикноза. Кариорексис – это раскалывание конденсированного хроматина на небольшие по объему, неправильной формы фрагменты, которые могут находиться внутри ядерной мембраны, если она сохранена, или располагаться в цитоплазме при ее деструкции. Кариопикноз представляет собой необратимую тотальную конденсацию хроматина по всей площади ядра. Ядро становится гомогенным, интенсивно базофильно окрашенным и сморщенным.

Морфометрический анализ показал, что доля дегенерирующих клеток в препарате опухоли, подверженной воздействию лазера, составляет 55,9% от общего числа клеток, в опухолевой ткани без воздействия – 7,1%. При этом 90% от числа дегенерирующих клеток опухоли, подверженной действию лазера, составляют клетки с кариорексисом. Среднее по 10 измерениям количество клеток с кариорексисом равно 8,1±1,2, в то время как в интактной опухолевой ткани результаты подсчета клеток с кариорексисом статистически незначимы (0,1±0,24).

Таким образом, на основании полученных результатов можно судить о том, что лазер с длиной волны 475 нм в выбранном режиме воздействия способен оказывать на опухоль повреждающее действие. Преимущества данного способа заключается в неинвазивности, отсутствии повреждающего действия на прилежащие здоровые ткани, а также в том, что данный способ воздействия на опухоль представляет собой монотерапию и не подразумевает введение в организм экспериментальных животных каких-либо дополнительных веществ, что позволяет сделать вывод о возможности расширения с помощью данного способа арсенала действующих средств.

Пример 1

Белой нелинейной крысе 2 интактной группы – самцу весом 235 г ввели подкожно в область правого бедра 0,5 мл физиологического раствора с кусочками опухолевого штамма лимфосаркомы (ЛФС) Плисса диаметром 1 мм, приобретенного в НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г.Москва). Опухоль развивалась в течение 14 дней, облучению животное не подвергалось и содержалось в стандартных условиях вивария. На 14 день после трансплантации опухоли была проведена декапитация животного под эфирным наркозом. Образцы опухолевой ткани для гистологического исследования фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, проводили по спиртам восходящей крепости и двум порциям хлороформа, а затем заливали в парафин. После приготовления парафиновых срезов опухолевой ткани толщиной 6 мкм их окрасили гематоксилином с эозином по общепринятой методике.

В результате исследования препаратов опухолевой ткани животных контрольной группы методом световой микроскопии на площади препарата, ограниченного сеткой, клеток с кариорексисом обнаружено не было.

Пример 2

Крысе 3 контрольной группы весом 247 г ввели подкожно в область правого бедра 0,5 мл физиологического раствора с кусочками опухолевого штамма лимфосаркомы (ЛФС) Плисса диаметром 1 мм, приобретенного в НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г.Москва). Со второго дня после прививки крысе 3 лимфосаркомы область растущей опухоли облучалась непрерывным низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 475 нм в количестве одного ежедневного сеанса продолжительностью 15 минут. На момент эвтаназии под эфирным наркозом срок роста опухоли составлял 14 дней. Животное содержалось в стандартных условиях вивария, декапитация осуществлялась под эфирным наркозом. Образцы опухолевой ткани для гистологического исследования фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, проводили по спиртам восходящей крепости и двум порциям хлороформа и заливали в парафин. После приготовления парафиновых срезов опухолевой ткани толщиной 6 мкм их окрасили гематоксилином с эозином по общепринятой методике. Морфометрический анализ показал, что среднее количество клеток с кариорексисом 10 измерениям в препарате опухоли, подверженной воздействию низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 475 нм, равно 8,1±1,2, что свидетельствовало о дистрофических изменениях в опухолевой ткани.

Источники информации

1. Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию. – М.: Медицина, 1980. – 216 с.

93025673 от 27.03.1996.

2079310 от 20.05.1997.

5. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. – М.: Медицина, 1971. – 272 с.

7 – С.91-93.

3039581 от 20.07.1995.

2 – С.217-221.

14. Карандашов В.И., Петухов Е.Б., Зродникова B.C. Фототерапия. – М. Медицина, 2001. – 392 с.

17. Карандашов В.И., Петухов Е.Б., Зродников B.C. Квантовая терапия. Под ред. Н.Р.Палеева. – М.: Медицина, 2004. – 335 с.

2288754 от 10.12.2006

19. Крюк С.А., Мостовников В.А., Хохлов И.В. Терапевтическая эффективность низкоинтенсивного лазерного излучения. – Минск, 1986.

20. Лазеры в клинической медицине, под ред. С.Д.Плетнева, М., 1981. – 400 с.

2 – С.95-99.

23. Стефанов С.Б. Цитология. – 1974. – Т.16, 11. – С.1439-1442

2005105485 от 10.08.2006.

Формула изобретения

Способ стимулирования дистрофических изменений в опухолевой ткани, заключающийся в том, что область опухоли облучают низкоинтенсивным лазерным излучением с длиной волны 475 нм по 15 мин за сеанс общим курсом 14 ежедневных сеансов.