Патент на изобретение №2378651

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИМИКОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ

(57) Реферат:

Способ относится к медицине и может быть использован в лабораторной практике для выявления антимикотической активности веществ в биологических жидкостях в процессе терапии грибковых заболеваний. Определение антимикотической активности веществ проводят путем приготовления суспензии дрожжевых клеток в жидкой среде, а именно в сыворотке крови с концентрацией дрожжевых клеток (3-5)·10⁵ КОЭ/мл; инкубацию – при комнатной температуре. После чего клетки отмывают и восстанавливают первоначальный объем суспензии дистиллированной водой. Полученную таким образом суспензию измельчают до однородного состояния, а измерение оптической плотности проводят при длине волн 340 нм. Разницу в показателях оптической плотности между испытуемой и (контрольной пробой принимают за величину антимикотической активности.

Способ относится к медицине и может быть использован в лабораторной практике для выявления антимикотической активности веществ в биологических жидкостях в процессе терапии грибковых заболеваний.

Известны способы определения концентрации антифунгальных препаратов с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (К.В.Alton. Determination of the antifungal agent, ketoconazole, in human plasma by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, Volume 221, Issue 2, 12 December 1980, Pages 337-344; К. К. Hosotsubo, H. Hosotsubo, М.К.Nishijima, et al. Rapid determination of serum levels of a new antifungal agent, fluconazole, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, Volume 529, 1990, Pages 223-228).

Однако для реализации данных методов требуется специальное дорогостоящее оборудование, приобретение которого для решения частных исследовательских задач нецелесообразно.

Биологические методы определения являются более доступными.

Известен способ определения антимикробных свойств веществ методом диффузии в уплотненную агар-агаром питательную среду. Этот способ имеет ограниченную область применения для выявления антимикотического действия веществ, содержащихся в биологических жидкостях, из-за особых требований, предъявляемых к тестовым грибковым культурам. Так как при использовании обычных лабораторных штаммов дрожжевых грибов (например, Candida albicans) затруднена количественная регистрация получаемых результатов, в данном методе исследователи используют особый специально выведенный мутантный штамм Candida albicans, обладающий повышенной чувствительностью к антимикотикам группы азолов (Marchetti О., Majcherczyk P.A., Glauser M.P., Bille J., Moreillon P., Sanglard D. (2001). Sensitive Bioassay for Determination of Fluconazole Concentrations in Plasma Using a Candida albicans Mutant Hypersusceptible to Azoles. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 696-700). Однако редкость, нестойкость таких штаммов, а также их узкая специфичность по отношению к группам антимикотиков существенно снижают практическую значимость данного метода.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения минимальных ингибирующих концентраций для ферментирующих видов дрожжей методом разведения в жидкой питательной среде (Определение минимальных ингибирующих концентраций (MIC) для ферментирующих видов дрожжей методом разведения в жидкой среде. – Ж. «Проблемы медицинской микологии», СПбМАПО, 2001, т.3, 4, с.20-28).

Способ предназначен для оценки действия различных концентраций антимикотических (антифунгальных) агентов на дрожжи. Способ основан на явлении торможения прироста биомассы дрожжевых клеток в жидкой питательной среде в присутствии веществ, обладающих антимикотическим (антифунгальным) действием.

Метод включает в себя приготовление суспензии с концентрацией (0,5-2,5)·10⁵ КОЭ/мл дрожжевых клеток в жидкой питательной среде (глюкозный агар Сабуро или пептонно-глюкозный агар), содержащей различные концентрации антимикотиков (испытуемые пробы) и не содержащей таковые (контрольная проба), инокуляцию дрожжевых клеток в питательную среду, инкубацию проб в течение 24 часов в термостате при температуре 37°С, учет результатов путем измерения оптической плотности при длине волны 530 нм и сравнения показателей контрольной и испытуемой пробы.

Однако данный способ неприемлем при изучении активности антимикотических агентов, присутствующих в крови в процессе терапии грибковых заболеваний. Эффективное действие антимикотика обеспечивается дозой препарата, накопленной в очаге поражения, в крови же концентрация антимикотически активных веществ довольно низка, и те количества препарата, которые позволяет регистрировать обсуждаемый метод, будут содержаться только в большом объеме крови, сопоставимом со всем объемом используемой жидкой питательной среды. Однако только замена жидкой питательной среды сывороткой крови вызывает затруднения в учете результатов исследования путем измерения оптической плотности.

К факторам негативного влияния относятся:

– высокая оптическая плотность сыворотки крови и низкая концентрация грибковой взвеси, приводящие к снижению аналитической чувствительности метода (способности выявлять наименьшие различия между двумя концентрациями исследуемого вещества);

– наиболее доступный и часто используемый в лабораторной практике тест-микроб Candida albicans при инкубации в сыворотке крови при 37,0°С формирует ростовые трубки, что приводит к неоднородности взвешенных частиц и, как следствие, значительному разбросу результатов и низкой воспроизводимости метода;

– при инкубации в питательной среде дрожжевые клетки, размножаясь, образуют клубки мицелия и псевдомицелия, размер которых, зависящий от присутствия в среде антимикотически активных продуктов, влияет на результаты производимого измерения, так как взвешенные частицы различной величины по-разному рассеивают свет, что существенно затрудняет проведение оценки накопления биомассы гриба и сравнительные исследования.

Задачей изобретения является разработка методики определения антимикотической активности веществ в крови в процессе терапии грибковых заболеваний.

Технический результат достигается тем, что в способе определения антимикотической активности веществ, включающем приготовление суспензии дрожжевых клеток в жидкой среде, инкубацию и измерение оптической плотности, суспензию готовят в сыворотке крови с концентрацией дрожжевых клеток (3-5)·10⁵ КОЭ/мл, а инкубацию проводят при комнатной температуре. Затем клетки отмывают и восстанавливают первоначальный объем суспензии дистиллированной водой. Полученную суспензию измельчают до однородного состояния, а измерение оптической плотности проводят при длине волн 340 нм. Разницу в показателях оптической плотности между испытуемой и контрольной пробами принимают за величину антимикотической активности.

Сущность изобретения заключается в изменении концентрации суспензии, условий инкубации и измерения оптической плотности и введении дополнительных приемов.

Увеличение концентрации суспензии дрожжевых клеток до величин (3-5)·10⁶ КОЭ/мл (вместо используемых в прототипе (0,5-2,5)·10⁶ КОЭ/мл) повышает аналитическую чувствительность метода.

Проведение инкубации дрожжевых клеток в сыворотке крови при комнатной температуре приводит к повышению однородности суспензии за счет снижения образования грибковыми клетками ростовых трубок, клубков мицелия и псевдомицелия.

Введение этапа замены жидкой фазы суспензии (в сыворотки крови на дистиллированную воду) (т.е. отмывание клеток дистиллированной водой и восстановление первоначального объема суспензии дистиллированной водой) снижает плотность жидкой фазы измеряемой суспензии и повышает аналитическую чувствительность метода, а измельчение полученной суспензии до однородного состояния позволяет уменьшить размер взвешенных частиц, что повышает оптическую плотность суспензии и обеспечивает повышение чувствительности и воспроизводимости метода.

Выбор для измерения самой короткой длины волны – 340 нм обусловлен ее оптимальностью при проведении турбидиметрических измерений.

Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемой совокупности признаков, приводящей к возможности определения антимикотической активности веществ в сыворотке крови, авторами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

Первоначально готовят суспензию 1-2-суточной культуры Candida albicans путем смыва с агара Сабуро 2-суточной культуры Candida albicans в физиологический раствор и доведения до концентрации 3-5·10⁶ КОЭ/мл и растворы антибиотиков – пенициллина и стрептомицина на стерильной дистиллированной воде, из расчета: пенициллин 100000 ЕД/мл, стрептомицина сульфат 0,1 г/мл. Затем к 1 мл сыворотки крови добавляют по 3 мкл раствора каждого антибиотика и 100 мкл суспензии 2-суточной культуры Candida albicans.

После чего полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 24 часов. После инкубации отмывают клетки дистиллированной водой 3 раза по 15-20 мин при 3000 об/мин. После отмывания восстанавливают первоначальный объем суспензии (1 мл) дистиллированной водой.

Полученную суспензию измельчают (например, путем проведения трехкратного цикла: замораживание жидким азотом (или в морозильной камере) и растирание пестиком) до однородного состояния, после чего измеряют ее оптическую плотность на фотометре при длине волны 340 нм.

Показатели испытуемой пробы (содержащей антимикотически активные вещества) сравнивают с показателями контрольной пробы (до приема антимикотического препарата), и за величину антимикотической активности сыворотки принимают разницу в их оптической плотности.

Данный способ применен при исследовании содержания антимикотически активных веществ в крови в процессе терапии грибковых заболеваний (вульвовагинальный кандидоз (ВВК), онихомикоз) у 21 пациента. Терапия проводилась препаратами итраконазола, флуконазола, тербинафина. В трех случаях (14,3%) профиль изменения антимикотической активности крови не соответствовал описанным в литературе фармакокинетическим кривым концентраций применяемых препаратов, заключающимся в непрерывном увеличении содержания препарата с пиками максимальной концентрации после приема очередной дозы для итраконазола и тербинафина и сохранении постоянной терапевтической концентрации препарата до приема следующей дозы для флуконазола. Анализ отдаленных результатов лечения выявил раннее возникновение рецидива заболевания у данных пациентов.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Пациентка К., 26 лет: длительность заболевания вульвовагинальным кандидозом (ВВК) – 3 года, клинические признаки кандидоза не исчезали после лечения, наступало лишь временное улучшение, часто случались обострения на фоне умеренной клинической картины. Ранее пациентка лечилась нистатином, итраконазолом малыми дозами с временным эффектом. Ей был прописан 7-дневный курс итраконазола. Антимикотическая активность сыворотки после приема первой дозы равнялась 0,163 у.е., а по завершении 7-дневного курса наблюдали существенное ее нарастание – до 0,268 у.е. При контрольном обследовании Candida не была обнаружена, клинические проявления отсутствовали.

Пример 2. Пациентка Г., 28 лет: длительность заболевания ВВК 11 лет, с постоянными клиническими признаками кандидоза, усиливающимися перед mensis. Предыдущая терапия включала клотримазол, орунгал 2 ч/з 6 мес., солкотриховак. Пациентке был назначен итраконазол в дозе 200 мг 1 раз в день в течение 7 дней. Значение антимикотической активности сыворотки после приема первой дозы составило 0,151 у.е., а при завершении курса наблюдали некоторое снижение показателя – 0,139 у.е. При проведении контроля терапии через 3 месяца у пациентки наблюдали рецидив кандидоза с умеренной клинической картиной.

Пример 3. Пациентка Л., 22 года: в течение 4 лет рецидивы вульвовагинального кандидоза наблюдались 3 раза в год, последние полгода клинические проявления приобрели постоянный характер. Предыдущее лечение осуществлялось нистатином, бороглицерином, флуконазолом малыми дозами. Пациентке был проведен курс лечения флуканазолом по схеме 150 мг в 3 дня, 5. После приема первой дозы антимикотическая активность сыворотки крови равнялась 0,170 у.е. и сохранялась на уровне 0,153-0,162 у.е. перед приемами следующих доз. При последующих контрольных исследованиях клинических и лабораторных признаков грибковой инфекции не наблюдалось.

Пример 4. Пациентка Г., 26 лет: болеет ВВК 5 лет, умеренные клинические проявления кандидоза имеют постоянный характер, усиливаются перед mensis. Ранее лечение не проводилось. Терапия проводилась препаратом флуконазола в режиме 150 мг в 3 дня, 5. Антимикотическая активность сыворотки крови после приема первой дозы составила лишь 0,076 у.е., а перед приемом следующей дозы практически отсутствовала – 0,003 у.е. По окончании терапии у данной пациентки сохранялись значительные творожистые выделения, и при обследовании через полгода в посеве вновь обнаружена С.albicans.

Формула изобретения

Способ определения антимикотической активности веществ, включающий приготовление суспензии дрожжевых клеток в жидкой среде, инкубацию и измерение оптической плотности, отличающийся тем, что суспензию готовят в сыворотке крови с концентрацией дрожжевых клеток (3-5)·10⁵ КОЭ/мл, а инкубацию проводят при комнатной температуре, затем клетки отмывают и восстанавливают первоначальный объем суспензии дистиллированной водой, полученную суспензию измельчают до однородного состояния, а измерение оптической плотности проводят при длине волн 340 нм, разницу в показателях оптической плотности между испытуемой и контрольной пробы принимают за величину антимикотической активности.