Патент на изобретение №2378365

(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ ДЛЯ СПИРТОВОГО ПРОИЗВОДСТВА

(57) Реферат:

Способ предусматривает культивирование дрожжей в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6%. В качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло. Культивирование ведут с подпиткой стерильным суслом до содержания сахара в питательной среде 4-6%. В культуральную жидкость при достижении в ней концентрации дрожжевых клеток 700 млн кл./мл вносят неионогенный ПАВ – проксанол в количестве 0,005-0,01 г/л. Осуществляют управление аэрацией и перемешиванием по дыхательному коэффициенту дрожжей. Дыхательный коэффициент поддерживают в период лаг-фазы в пределах 3,5-10 [гСО₂/гО₂], в период экспоненциальной фазы – в пределах 1,5-2,5 [гСО₂/гО₂], на последней ступени культивирования в пределах 20-35 [гCO₂/гO₂], выдерживая культуральную жидкость в течение 2-3 ч. Культивирование ведут до достижения концентрации дрожжевых клеток на каждой ступени культивирования 1500-2000 млн кл./мл. Способ позволяет получить дрожжи с высокой концентрацией клеток 1500-2000 млн кл./мл и с высокой бродильной активностью. 1 табл.

Изобретение относится к спиртовой промышленности, в частности к способу культивирования дрожжей для спиртового производства.

Известен способ культивирования микроорганизмов в присутствии проксанола в количестве 0,001-1,000 г/л, предварительно смешанного с дополнительным источником углерода в количестве, пропорциональном увеличению скорости массопередачи кислорода, внесенных в питательную среду в момент начала лимитирования биосинтеза кислородом (патент РФ 1559696, 1993 г. Способ культивирования микроорганизмов.).

Недостатком данного способа является невысокая концентрация дрожжевых клеток.

Наиболее близким по технической сущности является способ культивирования дрожжей для спиртового производства на питательной среде, в которой культивирование ведут в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло или сахарозу до достижения концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости на каждой ступени культивирования 500-1000 млн/мл, после чего культуральную жидкость последней ступени выдерживают в анаэробных условиях в течение 2-3 часов, в процессе культивирования ведут подпитку стерильным суслом или раствором сахарозы в продукте декантации послеспиртовой барды до содержания сахара в питательной среде 4-6% (патент РФ 2136746, Бюл. 25, 1999 г. Способ культивирования дрожжей для спиртового производства).

Недостатком данного способа является невысокая концентрация 500-1000 млн/мл дрожжевых клеток.

Задачей изобретения является создание способа культивирования дрожжей для спиртового производства, позволяющего получить чистую дрожжевую культуру с высокой концентрацией клеток 1500-2000 млн/мл и хорошим качеством.

Техническая задача в способе культивирования дрожжей для спиртового производства в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло, в процессе культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae p.XII, р. М, смесь р. XII и р. М, Y 717, р. 1976 ведут подпитку стерильным суслом до содержания сахара в питательной среде 4-6%, культивирование дрожжей ведут до достижения заданной концентрации дрожжевых клеток на каждой ступени культивирования, достигается тем, что при культивировании указанных дрожжей в культуральную жидкость при достижении в ней концентрации дрожжевых клеток 700 млн/мл вносят неионогенный ПАВ – проксанол в количестве 0,005-0,01 г/л, осуществляют управление аэрацией и перемешиванием по дыхательному коэффициенту дрожжей, поддерживая его в период лаг-фазы в пределах 3,5-10 [гСO₂/гO₂], в период экспоненциальной фазы роста – в пределах 1,5 – 2,5 [гСO₂/гO₂], и на последней ступени культивирования культуральную жидкость выдерживают в течение 2-3 часов, поддерживая значение дыхательного коэффициента в пределах 20-35 [гСO₂/гO₂], до достижения концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости на каждой ступени культивирования 1500-2000 млн/мл.

Предлагаемый способ позволяет увеличить концентрацию дрожжевых клеток до 4 раз по сравнению с прототипом и получить дрожжи с хорошим качеством и высокой бродильной активностью.

В заявленном способе используют продукт декантации послеспиртовой барды, полученной после ректификации бражки на сырцовой ректификационной установке. Послеспиртовая барда является отходом производства (см. журнал «Биотехнология», 6, 1997, с.43-46). Сусло готовят в соответствии с Регламентом производства спирта из крахмалистого сырья, часть 1 – М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1979. Проведена серия экспериментов на культурах дрожжей широко используемых в спиртовом производстве – Saccharomyces cerevisiae p.XII, р. М, смесь р. XII и р. М (в соотношении 1:1), Y 717, р. 1976. Установлено, что активный рост и накопление биомассы дрожжей при выбранных условиях культивирования характерны для всех заявленных культур.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.Чистую культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на сусле-агаре, пересевают в качалочные колбы объемом 750 мл на стерильную питательную среду объемом 50 мл с начальным содержанием сахара 4%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Частота встряхивания качалочных колб 220 об/мин.

В процессе культивирования дрожжей в качалочных колбах ведут подпитку стерильным суслом до содержания сахара в питательной среде 4%. При достижении концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости 700 млн/мл полученную дрожжевую культуру переносят в ферментер объемом 10 литров, куда добавляют стерильный 10% водный раствор неионогенного ПАВ – проксанола из расчета 0,005 г на литр культуральной жидкости. Культивирование дрожжей ведут в ферментере на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4%, в качестве которой используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Аппарат-ферментер для культивирования дрожжей оснащен самовсасывающей мешалкой, вращающейся со скоростью от 200 до 1400 об/мин.

В процессе культивирования дрожжей осуществляют управление аэрацией и перемешиванием культуральной жидкости по дыхательному коэффициенту дрожжей (RQ), который рассчитывается на основании газового баланса по следующей формуле (разницей между мольными объемами углекислого газа и кислорода при нормальных условиях пренебрегаем) (см. Мухачев С.Г. Определение параметров аэробного роста микроорганизмов на основе газового анализа. – Сб. XVIII международной конференции «Математические методы в технике и технологиях», 2005, т.6, с.160-163):

где: 0,00033 и 0,2095 – объемные доли соответственно углекислого газа и кислорода в сухом атмосферном воздухе;

0,7905 – объемная доля инертных газов в сухом воздухе, подаваемом на аэрацию;

O₂ и СO₂– объемные доли кислорода и углекислого газа в отработанном воздухе, выходящем из ферментера.

Для расчета величины дыхательного коэффициента (RQ) измеряют остаточную концентрацию кислорода и концентрацию углекислого газа в отработанном воздухе, выходящем из ферментера.

Измерения проводят с помощью газоанализаторов на углекислый газ (СO₂) и кислород (O₂): прибор ГИАМ-5 производства «Аналитприбор», г.Смоленск, кл.2 и ММГ-7, производства «Медтехника», г.Казань, кл.2. соответственно.

Первые 2-3 часа роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в период лаг-фазы, процесс культивирования дрожжей ведут, управляя режимными параметрами аэрации и перемешивания, поддерживая значение дыхательного коэффициента равным 3,5 [гСO₂/гO₂], в последующий экспоненциальный период роста дрожжевой культуры осуществляют управление аэрацией и перемешиванием культуральной жидкости, поддерживая дыхательный коэффициент на уровне 1,5 [г СO₂/гO₂].

В процессе подготовки питательной среды и подпиток, а также при культивировании дрожжей концентрацию сахара в культуральной жидкости определяют методом Бертрана, количество дрожжевых клеток – подсчетом клеток в камере Горяева (см. книгу «Микробиологический контроль гидролизно-дрожжевого производства». – М.: Экология, 1991 г., с.44-50; «Практикум по микробиологии» – М.: Издательство Моск. Ун-та, 1976, с.174-176).

По мере роста дрожжевой популяции при снижении содержания сахара в культуральной жидкости до рВ 2,5% проводят подпитку стерильным суслом с содержанием рВ 12-15% с внесенным в него стерильным 10% водным раствором неионогенного ПАВ – проксанола в концентрации 0,005 г на 1 литр подпитки. Подпитка возвращает содержание сахара в питательной среде к начальному значению.

При достижении концентрации дрожжевых клеток, равной 1500 млн/мл, дрожжевую культуру направляют на следующую ступень в ферментер объемом 500 литров и ведут процесс культивирования в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4%, управляя аэрацией и перемешиванием по соответствующему каждой стадии роста дрожжевой культуры дыхательному коэффициенту аналогично предыдущей ступени.

На последней ступени культивирования при достижении концентрации дрожжевых клеток 1500 млн/мл дрожжи Saccharomyces cerevisiae выдерживают в питательной среде с содержанием сахара 4% в течение 2-х часов, поддерживая значение дыхательного коэффициента дрожжей равным 20 [гСО₂/гО₂], для переключения дрожжевых клеток с дыхательного на анаэробный тип жизнедеятельности, перестройки ферментативного комплекса дрожжевой клетки для катализа брожения.

Бродильную активность и качество дрожжей определяют газометрическим методом (см. журнал «Пищевая промышленность», 11, 1989, с.37-38; книга «Контроль производства хлебопекарных дрожжей» автора О.А.Бакушинской, – М.: Пищевая пром-ть, 1978 г.)

Качество выращенных дрожжей – хорошее.

Пример 2. Чистую культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на сусле-агаре, пересевают в качалочные колбы объемом 750 мл на стерильную питательную среду объемом 50 мл с начальным содержанием сахара 6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Частота встряхивания качалочных колб 220 об/мин.

В процессе культивирования дрожжей в качалочных колбах при снижении сахара в культуральной жидкости до рВ 2,5% ведут подпитку стерильным суслом (рВ 12-15%) до содержания сахара в питательной среде 6%. При достижении концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости 700 млн/мл полученную дрожжевую культуру переносят в ферментер объемом 10 литров, куда добавляют стерильный 10% водный раствор неионогенного ПАВ – проксанола из расчета 0,01 г ПАВ на литр культуральной жидкости. Культивирование дрожжей ведут в ферментере на стерильной питательной среде с содержанием сахара 6%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Процесс культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae осуществляют, управляя аэрацией и перемешиванием, которые определяются часом роста дрожжевой культуры и соответствующим ему дыхательным коэффициентом. В период лаг-фазы (первые 2-3 часа роста) режимные параметры аэрации и перемешивания устанавливают такими, чтобы дыхательный коэффициент был равным 10 [гСO₂/гO₂], в период интенсивного роста (последующие 10-12 часов), в экспоненциальной фазе, дыхательный коэффициент поддерживают на уровне 2,5 [гСO₂/гО₂].

В процессе культивирования дрожжей проводят подпитку стерильным суслом (рВ 12-15%) с добавлением в него стерильного 10% водного раствора проксанола в концентрации 0,01 г/л, возвращая содержание сахара в питательной среде к начальному значению.

При достижении концентрации дрожжевых клеток, равной 1700 млн/мл, дрожжевую культуру направляют на следующую ступень в ферментер объемом 500 литров и ведут процесс в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 6%, аналогично предыдущей степени.

На последней ступени культивирования при достижении концентрации дрожжевых клеток 1700 млн/мл дрожжи выдерживают в питательной среде с содержанием сахара 6% в течение 3-х часов, поддерживая значение дыхательного коэффициента равным 35 [гСО₂/гO₂], что необходимо для переключения дрожжевых клеток с дыхательного на анаэробный тип жизнедеятельности.

Качество выращенных дрожжей – хорошее.

Пример 3. Чистую культуру дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выращенную на сусле-агаре, пересевают в качалочные колбы объемом 750 мл на стерильную питательную среду объемом 50 мл с начальным содержанием сахара 5%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

Частота встряхивания качалочных колб 220 об/мин.

В процессе культивирования при снижении сахара в культуральной жидкости до 2,5% ведут подпитку стерильным суслом (рВ 12-15%) до содержания сахара в питательной среде 5%. При достижении концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости качалочных колб 700 млн/мл полученную дрожжевую культуру переносят в ферментер объемом 10 литров, куда добавляют стерильный 10% водный раствор неионогенного ПАВ – проксанола из расчета 0,0075 г ПАВ на литр культуральной жидкости. Культивирование дрожжей ведут в ферментере на стерильной питательной среде с содержанием сахара 5%, в качестве питательной среды используют продукт декантации послеспиртовой барды и сусло.

В процессе культивирования дрожжей осуществляют управление аэрацией и перемешиванием по дыхательныму коэффициенту дрожжей. В период лаг-фазы (первые 2-3 часа роста дрожжевой культуры) режимные параметры устанавливают такими, чтобы дыхательный коэффициент был равен 7 [гCO₂/гO₂], в период интенсивного роста (последующие 10-12 часов), в экспоненциальной фазе, дыхательный коэффициент поддерживают на уровне 2 [гCO₂/гO₂].

В процессе культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae проводят подпитку стерильным суслом (рВ 12-15%) с добавлением в него стерильного 10% водного раствора проксанола в концентрации 0,0075 г/л, возвращая содержание сахара в питательной среде к начальному значению.

При достижении концентрации дрожжевых клеток, равной 2000 млн/мл, дрожжевую культуру направляют на следующую ступень в ферментер объемом 500 литров и ведут процесс в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 5%, аналогично предыдущей степени.

На последней ступени культивирования при достижении концентрации дрожжевых клеток 2000 млн/мл дрожжи выдерживают в питательной среде с содержанием сахара 5% в течение 2,5 часов, поддерживая значение дыхательного коэффициента равным 27 [гСO₂/гO₂], для переключения дрожжевых клеток с дыхательного на анаэробный тип жизнедеятельности.

Качество выращенных дрожжей – хорошее.

Пример 4. Культивирование дрожжей ведут так же, как и в примере 3, но без добавления неионогенного ПАВ – проксанола. Концентрация дрожжевых клеток составляет 1700 млн/мл. Качество дрожжей – хорошее.

Дрожжи, полученные по примерам 1-4, обладают высокой бродильной активностью и хорошим качеством. При выборе запредельных границ концентраций ПАВ, значений дыхательного коэффициента, процентного содержания сахара в питательной среде, значений времени выдержки на последней ступени культивирования поставленная задача (уровень концентрации дрожжевых клеток на каждой ступени культивирования 1500-2000 млн/мл) не обеспечивается, чем и обусловлен выбор предельных значений данных параметров.

Концентрация и качество дрожжей по примерам 1-4 представлены в табл.1.

Таким образом, предлагаемый способ культивирования дрожжей позволяет вырастить чистую дрожжевую культуру в любых объемах путем последовательного пересева с предыдущей ступени на последующую, к тому же с высокой концентрацией дрожжевых клеток 1500-2000 млн/мл и хорошим качеством дрожжей. Заявленный способ прост в технологическом исполнении, питательная среда, используемая в способе, содержит основной компонент – продукт декантации послеспиртовой барды, являющейся отходом спиртового производства.

Предлагаемое изобретение «Способ культивирования дрожжей для спиртового производства» по сравнению с прототипом обеспечивает увеличение концентрации спиртовых дрожжей до 2000 млн/мл с хорошим качеством.

Формула изобретения

Способ культивирования дрожжей для спиртового производства в аэробных условиях на стерильной питательной среде с содержанием сахара 4-6% с использованием в качестве питательной среды продукта декантации послеспиртовой барды и сусла, с подпиткой в процессе культивирования дрожжей стерильным суслом до содержания сахара в питательной среде 4-6% и ведением культивирования до достижения заданной концентрации дрожжевых клеток на каждой ступени, культивирования, отличающийся тем, что при культивировании дрожжей в культуральную жидкость при достижении в ней концентрации дрожжевых клеток 700 млн кл./мл вносят неионогенный ПАВ – проксанол в количестве 0,005-0,01 г/л, осуществляют управление адрацией и перемешиванием по дыхательному коэффициенту дрожжей, поддерживая его в период лаг-фазы в пределах 3,5-10 [гСО₂/гО₂], в период экспоненциальной фазы роста – в пределах 1,5-2,5 [гСО₂/гО₂] и на последней ступени культивирования культуральную жидкость выдерживают в течение 2-3 ч, поддерживая значение дыхательного коэффициента в пределах 20-35 [гСО₂/гО₂], до достижения концентрации дрожжевых клеток в культуральной жидкости на каждой ступени культивирования 1500-2000 млн кл./мл.