Патент на изобретение №2378360

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ ОТ НЕПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Выявляют в составе микробных клеток поверхностный антигенный комплекс (Аг 8) в ракетном иммуноэлектрофорезе с использованием сыворотки иммунной козьей, содержащей антитела к данному антигену, выделенному из В.pseudomallei 100 формамидом, с титром антител в РИД 1:16-1:32. После остановки электрофореза пластинки просматривают, наличие пиков преципитатов в геле свидетельствует о присутствии антигенного комплекса 8 патогенных В.pseudomallei и В.mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий. Изобретение позволяет быстро дифференцировать патогенных возбудителей мелиоидоза и сапа от непатогенных для людей буркхольдерий и близкородственных микроорганизмов. 3 ил., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, лабораторной диагностике и касается обнаружения поверхностного антигенного комплекса 8 (Аг 8), являющегося одним из факторов патогенности возбудителей сапа (Burkholderia mallei) и мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei).

Изобретение может быть использовано для серологического дифференцирования патогенных В.pseudomallei и В.mallei от их непатогенных вариантов и других близкородственных буркхольдерий.

1. – С.7-11).

6. – С.94-99).

5. – С.19-24).

Для дальнейших исследований представляет интерес проводить первичный отбор перспективных капсульных иммуногенных с протективной активностью штаммов сапных и мелиоидозных бактерий от других видов буркхольдерий.

3. – С.19-24).

2286576). Авторы указывают, что антигенный спектр близкородственных видов В.mallei и В.thailandensis весьма схож с В.pseudomallei, поэтому данный методический подход позволяет выявлять у них индивидуальные протеиновые антигены, но не дифференцировать их друг от друга.

4. – С.50-52). Авторы указывали на различия в интенсивности биосинтеза антигена 8 у патогенных буркхольдерий двух видов, близкородственные микроорганизмы при этом не исследовались.

Наиболее близким аналогом является изучение перекрестно-реагирующих антигенов у бактерий сапа и мелиоидоза и других возбудителей опасных инфекционных заболеваний, используя иммунные сыворотки к общеклеточным белкам В.pseudomallei и В.mallei с помощью двунаправленного ракетного иммуноэлектрофореза (РИЭФ). Авторы применяли буферный раствор, приготовленный из диэтилбарбитуровой кислоты, трис, лактата кальция и азида натрия с рН, равной 8,6. Ракетный иммуноэлектрофорез проводили с использованием системы охлаждения при 15°С в течение 18 ч, в градиенте потенциала 1,5 В/см. Затем выполняли процедуру отмывки, высушивания и окрашивания агарозных пластин. Показано, что белки мелиоидозных и сапных микроорганизмов в РИЭФ с гомологичными сыворотками формируют пики преципитатов как в катодной (4-5 пиков), так и в анодной (8-9 пиков) области геля. Однако сведения об антигенных взаимоотношениях В.pseudomallei, В.mallei, В.thailandensis, В.cepacia и В.gladioli отсутствуют (Изучение перекрестно-реагирующих антигенных комплексов патогенных буркхольдерий и других возбудителей опасных инфекционных заболеваний: Отчет о НИР (заключит.) / Волгогр. науч.-исслед. противочум. ин-т. – Волгоград, 2002. – ГР 01.2.00 104720. – 44 с.).

Целью изобретения является разработка быстрого способа дифференцирования патогенных возбудителей мелиоидоза и сапа от непатогенных для людей буркхольдерий и близкородственных микроорганизмов.

1. – С.47-52).

Авторами изобретения предпринимались попытки проводить дифференцирование патогенных буркхольдерий от непатогенных с помощью ракетного иммуноэлектрофореза, используя различные условия его постановки. Были испытаны несколько буферных растворов с ионной силой 0,016-0,032 (веронал-мединаловый с лактатом кальция, рН 8,6; мединал-солянокислый, рН 8,6; барбитал-трис-глициновый, рН 8,8). Варьировали величину напряженности электрического поля (2-12 В/см), длительность (2-18 ч), температуру (10-15°С).

В процессе исследований были подобраны следующие условия постановки РИЭФ: пластинку “GelBond” размером 8,5×10 см заливают 1% агарозой фирмы «Calbiochem», приготовленной на барбитал-трис-глициновом буфере с ионной силой, равной 0,016, рН 8,8. На расстоянии 3 см от края пластинки с анодной стороны пробивают ряд лунок диаметром 4 мм. Отступив 2 мм от лунок, вырезают полоску геля шириной 2,5 см. Гель растапливают на водяной бане, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 0,5-2% по объему сыворотки, содержащей антитела к антигену 8, и снова заливают на пластинку. В лунки вносят исследуемый антигенный материал (взвесь высушенных ацетоном бактериальных клеток в физиологическом растворе, рН 7,2, или их водно-солевой экстракт). К краям геля прикладывают мостики из 6 слоев фильтровальной бумаги, обильно смоченные электродным буфером. Электрофорез проводят при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках, равной 0,02, напряженности 10-12 В/см в течение 3,5-4 ч и температуре 12°С. После остановки электрофореза пластинки просматривают. Наличие пиков преципитатов в геле свидетельствует о присутствии антигенного комплекса 8 патогенных В.pseudomallei и В.mallei. Отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных штаммов.

Исследование по этому признаку штаммов с помощью ракетного иммуноэлектрофореза в данной модификации с антителами, полученными к антигену 8, может быть использовано при изучении антигенного материала количественно путем сравнения высоты пиков преципитатов исследуемого образца и контрольной пробы с известным содержанием Аг 8 при лабораторной диагностике сапа и мелиоидоза.

Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.

Пример 1. Дифференцирование патогенных инкапсулированных штаммов (Аг 8⁺) В.pseudomallei и В.mallei от их бескапсульных вариантов (Аг 8⁺) и близкородственных буркхольдерий.

Ракетный иммуноэлектрофорез проводят на пластинке “GelBond” размером 8,5×10 см, которую заливают 1% агарозой фирмы «Calbiochem», приготовленной на барбитал-трис-глициновом буфере с ионной силой, равной 0,016, рН 8,8. На расстоянии 3 см от края пластинки с анодной стороны пробивают ряд лунок диаметром 4 мм. Отступив 2 мм от лунок, вырезают полоску геля шириной 2,5 см. Гель растапливают на водяной бане, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 0,5-2% по объему сыворотки, содержащей антитела к антигену 8, и снова заливают на пластинку. В лунки вносят исследуемые микробные клетки, высушенные ацетоном, или их водно-солевые экстракты: В.pseudomallei 60913 (Аг 8⁺), 51274 (Аг 8⁺), 57576 (Аг 8⁺), 100 (Аг 8⁺), 100-6-1 (Аг 8^–), В.mallei В-120 (Аг 8⁺), 10230 (Аг 8⁺), 10230-11-2 (Аг 8⁺), В.thailandensis 264, 251, 294, 295, B. cepacia 25416, 1934, P. allicola 8495. В качестве положительного контроля используют антигенный комплекс 8, выделенный из В.pseudomallei 100 формамидом, и водно-солевой экстракт В.pseudomallei 100. К краям геля прикладывают мостики из 6 слоев фильтровальной бумаги, обильно смоченные электродным буфером. Электрофорез проводят при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках, равной 0,02, напряженности 12 В/см, в течение 4 ч и температуре 12°С. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие пиков преципитатов в геле свидетельствует о присутствии антигенного комплекса 8 патогенных В.pseudomallei и В.mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий (фиг.1 и фиг.2).

Пример 2. Изучение патогенных и непатогенных буркхольдерий в РИЭФ при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках 0,032.

Ракетный иммуноэлектрофорез проводят как описано в примере 1. В лунки вносят исследуемые водно-солевые экстракты микробных клеток, не содержащих антиген 8: В.thailandensis 264, 251, 294, 295, В.cepacia 25416, 1934, P. allicola 8495. В качестве положительного контроля используют антигенный комплекс 8, выделенный из В.pseudomallei 100 формамидом, и водно-солевой экстракт В.pseudomallei 100. К краям геля прикладывают мостики из 6 слоев фильтровальной бумаги, обильно смоченные электродным буфером. Электрофорез проводят при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках, равной 0,032, напряженности 12 В/см, в течение 4 ч и температуре 12°С. После остановки электрофореза пластинки просматривают.

Наличие пиков преципитатов в геле у всех исследуемых штаммов при данных условиях РИЭФ не позволяет дифференцировать патогенные В.pseudomallei и В.mallei от непатогенных буркхольдерий (фиг.3).

Сводные результаты представлены в таблице 1.

Таким образом, разработан быстрый способ дифференцирования патогенных возбудителей сапа и мелиоидоза, относящихся к особо опасным инфекциям, от их непатогенных вариантов и близкородственных буркхольдерий за счет подбора условий РИЭФ (изменения ионной силы буферного раствора в электродных отсеках, напряженности электрического поля, длительности и температуры) с сывороткой, содержащей антитела к антигенному комплексу 8, который отличает простота и быстрота исполнения, наглядность, возможность количественной оценки результатов, отсутствие потребности в сложном оборудовании. Данный способ может применяться в комплексной диагностике сапа и мелиоидоза как дополнительный метод выявления патогенных В.pseudomallei и В.mallei.

Формула изобретения

Способ дифференцирования патогенных от непатогенных буркхольдерий, включающий получение антигенного препарата, ракетный иммуноэлектрофорез исследуемых микроорганизмов и последующий учет результатов, отличающийся тем, что для быстрого выявления антигенного комплекса (Аг 8) в штаммах с использованием сыворотки иммунной козьей, содержащей антитела к данному антигену, выделенному из В.pseudomallei 100 формамидом, с титром антител в РИД 1:16-1:32, ракетный электрофорез проводят в следующей постановке: пластинку “GelBond” размером 8,5×10 см заливают 1%-ной агарозой фирмы «Calbiochem», приготовленной на барбитал-трис-глициновом буфере с ионной силой, равной 0,016, рН 8,8, на расстоянии 3 см от края пластинки с анодной стороны пробивают ряд лунок диаметром 4 мм, отступив 2 мм от лунок, вырезают полоску геля шириной 2,5 см, гель растапливают на водяной бане, охлаждают до 48°С, добавляют к нему 0,5-2% по объему сыворотки, содержащей антитела к антигену 8, и снова заливают на пластинку, в лунки вносят исследуемый антигенный материал (взвесь высушенных ацетоном бактериальных клеток в физиологическом растворе, рН 7,2, или их водно-солевой экстракт), к краям геля прикладывают мостики из 6 слоев фильтровальной бумаги, обильно смоченные электродным буфером, электрофорез проводят при ионной силе буферного раствора в электродных отсеках, равной 0,02, напряженности 10-12 В/см в течение 3,5-4 ч и температуре 12°С, после остановки электрофореза пластинки просматривают, наличие пиков преципитатов в геле свидетельствует о присутствии антигенного комплекса 8 патогенных В.pseudomallei и В.mallei, отрицательный результат указывает на отсутствие антигенов патогенных буркхольдерий.

РИСУНКИ