Патент на изобретение №2378060

(54) БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЙ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Биопрепарат содержит биомассу следующих штаммов бактерий: Pseudomonas sp.BKM В-2387Д, Pseudomonas putida BKM В-2380Д, Rhodococcus sp.BKM Ас-2532Д и Rhodococcus sp.BKM Ас-2533Д в равных соотношениях для жидкой формы и сухой формы биопрепарата. Для сухой формы биопрепарата он дополнительно содержит защитную среду при соотношении биомасса: защитная среда, равном 1:(1-1,5). Данный препарат получен путем глубинного культивирования смешанной бактериальной ассоциации штаммов бактерий Pseudomonas sp.BKM В-2387Д, Pseudomonas putida BKM В-2380Д, Rhodococcus sp.BKM Ас-2532Д и Rhodococcus sp.BKM Ас-2533Д на полусинтетической питательной среде. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами включает внесение рабочего раствора биопрепарата из расчета 10 л/м² по п.1 в концентрации 1×10⁷-1×10⁸ КОЕ/мл и комплексное минеральное удобрение «Нитроаммофоска» в концентрации 20-200 г/м². Изобретение позволяет повысить эффективность очистки нефтезагразненных почв, а именно позволяет произвести эффективную очистку в широком диапазоне температур окружающей среды, а также в условиях засоленности места загрязнения. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к экологии и биотехнологии, а именно к технологическому использованию ассоциации микроорганизмов для очистки почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, состоящий из консорциума мезофильных бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1 и консорциума психрофильных бактериальных штаммов Pseudomonas fluorescens ПИ ЛБХ-3, Pseudomonas putida ПИ ЛБХ-3, Xantomonas species ПИ ЛБХ-7, минеральных добавок и наполнителя (RU 2138451, C02F 3/34, 1997.12.05).

Недостатком данного биопрепарата является то, что в качестве минеральных добавок он содержит карбамид, двойной суперфосфат, калий сернокислый, а не одно комплексное удобрение.

Известен биопрепарат «Родер» на основе только R-диссоциантов штаммов Rhodococcus ruber BKM Ас-1513Д и Rhodococcus erythropolis BKM Ас-1514Д (RU 2174496, C02F 3/34, 1999.05.31). Отселекционированные микроорганизмы, входящие в состав препарата, способны размножаться и деградировать углеводороды нефти в широком диапазоне солености (0,05-10%, оптимальная соленость среды 3-5%) и температур (8-35°С, оптимальная температура 25-27°С).

Недостатком этого биопрепарата является неспособность входящих в его состав микроорганизмов деградировать нефть при пониженных температурах и низкие скорости роста. А также то, что в состав биопрепарата входят представители только рода Rhodococcus. Как известно биопрепараты, состоящие микроорганизмов разных таксономических групп, более эффективно утилизируют нефть и нефтепродукты.

Известен способ получения биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий глубинное культивирование нефтеокисляющих бактерий на жидкой искусственной питательной среде, добавление в герметичные емкости наполнителя и минеральных добавок (RU 2116145, C02F 3/34, 1996.06.07).

Недостатком данного способа является получение только жидкой формы биопрепарата, что не всегда удобно при транспортировке биопрепарата к месту загрязнения, и ограниченный срок годности.

Известен способ получения бактериального препарата, предусматривающий наращивание биомассы бактерий рода Pseudomonas на среде, содержащей азот, фосфор, калий, и последующее ее высушивание. После наращивания биомассы бактерий в среду дополнительно вносят пероксид водорода и хлорид кальция для образования биофлоков, после чего перед высушиванием биомассу наносят на сфагновый торф (RU 2033975, C02F 3/34, 1991.06.28).

Недостатком является отсутствие в выращенной биомассе веществ, которые сохраняют жизнеспособность бактериальных клеток после высушивания, например растворов защитных сред.

Известен способ очистки водоемов и почв от нефтяных загрязнений, предусматривающий нанесение препарата углеводородокисляющих микроорганизмов на нефтесубстрат загрязненного участка, в котором микроорганизмы препарата перед упомянутым нанесением культивируют в среде, содержащей нефтесубстрат загрязненного участка, взятый в количестве, обеспечивающем симбиотический рост углеводородокисляющих микроорганизмов препарата и нефтесубстрата загрязненного участка (RU 2104248, C02F 3/34, 1996.03.26). В способе предполагается специальная подготовка входящих в состав препарата микроорганизмов перед его нанесением на нефтезагрязнение.

Его недостатком является то, в условиях реального нефтяного загрязнения нет возможности предварительно культивировать микроорганизмы в среде, содержащей нефтесубстрат загрязненного участка (около 14 дней).

Известен способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, в котором в качестве биопрепарата используют консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Kу-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении от 3-12 мас.% каждого микроорганизма, при этом совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин в количестве 30-120 г/м² (RU 2191643, В09С 1/10, 2001.07.09), где ризоторфин – землеудобрительный препарат азотфиксирующих микроорганизмов.

Данный способ позволяет эффективно уничтожать нефтезагрязнения в присутствии солей тяжелых металлов.

Недостатком является то, что при приготовлении рабочей суспензии микроорганизмов температура поддерживается на уровне 18-22°С, т.е. микроорганизмы, входящие в состав консорциума, неспособны к деградации нефтепродуктов при пониженных температурах.

Известен способ очистки почвы, природных и сточных вод с использованием биопрепаратов, в частности консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов “Деворойл” (консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica), включающий хранение или доставку изготовленных биопрепаратов к загрязненной территории или акватории, подготовку биопрепаратов к использованию и внесение их в очищаемую среду. Этот способ предусматривает при хранении суспензии микроорганизмов использование NaCl, биологически активных веществ (витамины) и осмопротекторов (бетаин) (RU 2114071, C02F 3/34, 1997.05.22).

Недостатком является то, что несмотря на добавление к бактериальной суспензии защитных веществ численность микроорганизмов снижается независимо от температуры хранения.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов – Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта-Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес.% и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 м³ почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию – засев многолетними травами (RU 2193464, В09С 1/10, 2001.11.14).

Однако вышеописанный способ предполагает использование твердо-жидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и не применим при масштабных авариях и разливах нефти и нефтепродуктов.

Задача данного изобретения состоит в создании эффективного способа очистки почв от загрязнения нефтью и нефтепродуктами с использованием нового биопрепарата.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемых изобретений, состоит в том, что микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата, способны работать в широком диапазоне температур окружающей среды (2-32°С), а также в условиях засоленности места загрязнения.

Согласно изобретению данная задача решается за счет того, что в способе очистки от нефти и нефтепродуктов предусматривается введение в загрязненную среду суспензии биопрепарата, содержащего микроорганизмы-деструкторы нефти.

Достижению технического результата способствует и то, что в качестве биопрепарата используют ассоциацию психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти, содержащую штаммы родов Rhodococcus и Pseudomonas, а также защитные среды.

В состав биопрепарата входят следующие микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти: штаммы бактерий Pseudomonas sp. BKM В-2387Д, Pseudomonas putida BKM В-2380Д, Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д, которые депонированы во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов.

Штамм бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д выделен из сточных вод резинотехнического завода.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные прямые, изогнутые палочки размером 0,7-0,8×1,6-2,8 мкм, часто культура распадается на кокковые формы. Культура неподвижна. На стандартных питательных средах (МПА, LB) через 48 часов образует мелкие, шероховатые колонии кремового цвета.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Растет в температурном диапазоне от 2°С до 32°С, оптимум 25°С. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Использует в качестве источника роста нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти. В дополнительных факторах роста микроорганизм не нуждается.

Штамм бактерий Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д выделен из почвы с территории автозаправочной станции.

Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные прямые, изогнутые палочки размером 0,7-0,8×1,6-2,8 мкм, часто культура распадается на кокковые формы. Культура неподвижна. На стандартных питательных средах (МПА, LB) через 48 часов образует мелкие, шероховатые колонии кремового цвета.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Растет в температурном диапазоне от 2°С до 32°С, оптимум 25°С. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl. Оксидазный тест отрицательный. Каталазный тест положительный. Использует в качестве источника роста нефть, нефтепродукты и отдельные углеводороды нефти. В дополнительных факторах роста микроорганизм не нуждается.

Штамм бактерий Pseudomonas sp. BKM В-2387Д выделен из почвы, загрязненной креозотом.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные прямые или изогнутые палочки размером 0,8-0,9×1,5-3 мкм. На стандартных питательных средах (МПА, LB, King В) образует круглые колонии 2-3 мм в диаметре, плоские, гладкие, края слегка неровные, белые, непрозрачные.

Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregersen (1978) – грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при +41°С. Не обладает способностью к денитрификации с образованием азота. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, сукцинат. Использует в качестве источника роста углеводороды бензоат, салицилат, нафталин, фенантрен, нефть и дизельное топливо. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl.

Генетические признаки.

Микроорганизм содержит конъюгативную плазмиду биодеградации ПАУ pNF142 размером 90 т.п.н. Наличие конъюгативной плазмиды, содержащей гены биодеградации ПАУ, способствует увеличению деградативного потенциала за счет распространения генов среди аборигенных микроорганизмов.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д выделен из очистных сооружений коксогазового комбината.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные прямые или изогнутые палочки размером 0,8-0,9×1,5-3 мкм. На стандартных питательных средах (МПА, LB, King В) образует круглые колонии 2-3 мм в диаметре, плоские, гладкие, края слегка неровные, белые, непрозрачные.

Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregersen (1978) – грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при +41°С. Не обладает способностью к денитрификации с образованием азота. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, сукцинат. Использует в качестве источника роста углеводороды бензоат, салицилат, нафталин, фенантрен, нефть и дизельное топливо. Оптимум рН для роста 6,0-8,0. Способен к росту в присутствии 3% NaCl.

Генетические признаки.

Микроорганизм содержит две плазмиды размером 100 и 50 т.п.н. Плазмида pBS1141 размером 100 т.п.н. содержит гены биодеградации нафталина и фенантрена, конъюгативна и относится к Р9 группе несовместимости. Наличие конъюгативной плазмиды, содержащей гены биодеградации ПАУ, в штамме бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д способствует увеличению деградативного потенциала за счет распространения генов среди аборигенных микроорганизмов.

Плазмида pBS1142 размером 50 т.п.н. является криптической и не содержит генов биодеградации.

Данные штаммы бактерий способны к деградации нефти и нефтепродуктов в широком температурном диапазоне (2-32°С), а также в условиях засоленности места загрязнения. Изучение способности микроорганизмов к росту на нефти и дизельном топливе в присутствии 3-5% NaCl в жидкой минеральной среде при 24°С и 4-6°С показало, что все штаммы-деструкторы способны к деградации нефти и дизельного топлива в присутствии соли. Кроме того, микроорганизмы, входящие в состав ассоциации, способны продуцировать биоэмульгаторы, повышающие доступность трудноразлагаемых субстратов (нефть и нефтепродукты) и увеличивающие эффективность деградации таких загрязнителей (Филонов А.Е., Нечаева И.А., Гафаров А.Б., Аринбасаров М.У., Пунтус И.Ф., Суни С., Романчук М., Воронин A.M. Биодеградация нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами и ее адсорбция растительным сорбентом в жидкой минеральной среде. Биотехнология, 2007, 2, с.31-39).

Важно, что предлагаемые представители рода Pseudomonas несут в своем составе катаболические плазмиды, горизонтальный перенос которых путем конъюгации в аборигенные микроорганизмы в природе приводит к увеличению пула бактерий, способных к деградации углеводородов.

В качестве защитной среды для сублимационного высушивания используют среды следующего состава:

1. 3-10%-ный раствор сахарозы;

2. 1-3%-ный раствор тиомочевины;

3. 1-2%-ный раствор полиглюкина;

4. 3%-ный раствор тиомочевины +5%-ный раствор сахарозы;

5. 2%-ный раствор тиомочевины +4%-ный раствор сахарозы +2%-ный раствор полиглюкина.

Для получения биопрепарата для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами проводят глубинное культивирование смешанной бактериальной ассоциации штаммов бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-2387Д, Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д, Rhodococcus sp. ВКМ Ас-2532Д и Rhodococcus sp. ВКМ Ас-2533Д на полусинтетической питательной среде.

Способ получения бактериальной биомассы нефтеокисляющих микроорганизмов на основе указанных выше штаммов Pseudomonas и Rhodococcus включает следующие стадии:

– получение рабочей культуры на скошенном агаре;

– приготовление глубинных посевных культур в колбах;

– выращивание нативной культуры в ферментерах;

– сепарирование на проточном сепараторе;

– получение жидкой формы препарата;

– добавление защитных сред, замораживание и сублимационная сушка препарата.

Приготовление смешанной культуры штаммов микроорганизмов проводят при раздельном приготовлении посевного материала, при этом для глубинного культивирования в ферментер сначала вносят посевной материал родококков, а через 6-14 часов после начала процесса культивирования вносят посевной материал псевдомонад. Возможно раздельное выращивание штаммов в разных ферментерах. В процессе выращивания величину рН в интервале 6,9-7,1 поддерживают автоматически подачей раствора аммиака. Процесс завершают через час после прекращения образования «кислых» продуктов культурой и повышения уровня рН до 7,3-7,4.

Хранение при температуре 4-6°С до 1 месяца, при -20°С до 1 года, в лиофилизированном виде до 5 лет и/или доставку изготовленного биопрепарата осуществляют в виде концентрированной суспензии (КС) с плотностью микроорганизмов 1×10¹⁰-1×10¹¹ КОЕ/мл или в высушенном (лиофилизированном) виде.

Для сохранения биомассы в активном состоянии при получении сухой формы биопрепарата необходимо в полученную КС добавлять защитные среды такие как, растворы сахарозы, тиомочевины, полиглюкина при соотношении биомасса: защитная среда, равном 1:(1-1,5).

Предлагается следующий способ для очистки почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами с использованием предлагаемого биопрепарата:

1) удаление загрязнителя механическими способами;

2) рыхление или вспашка;

3) внесение предлагаемого биопрепарата;

4) внесение комплексного минерального удобрения;

5) внесение древесных опилок;

6) поддержание влажности путем полива на определенном уровне;

7) засев смесью однолетних и многолетних трав.

Механическое удаление нефти или нефтепродуктов с загрязненной поверхности необходимо в случае сильного разлива, когда имеются участки с накоплением невпитавшейся нефти. Это позволит снизить уровень загрязнения до 5-10 вес.%, необходимого для применения микробиологических методов очистки.

Рыхление или вспашка почвы (в зависимости от размера загрязненной территории) необходимы для увеличения воздушного объема почвы и улучшения структуры почвы.

Для приготовления рабочего раствора 0,1-1 кг концентрированной суспензии

(1×10¹⁰-1×10¹¹ КОЕ/мл) биопрепарата вносят при перемешивании в емкость, содержащую 9 л пресной воды. Перемешивание осуществляют до полного исчезновения осадка. Готовый раствор (1×10⁹-1×10¹⁰ КОЕ/мл) затем переносят в емкость с 900 л пресной воды и перемешивают. Таким образом, рабочий раствор биопрепарата содержит микроорганизмы в концентрации 1×10⁷-1×10⁸ КОЕ/мл.

На очищаемую поверхность рабочий раствор наносят из расчета 10 л/м². Нанесение в загрязненную среду осуществляют разбрызгиванием или дождеванием с помощью любых машин и средств, предназначенных для этого процесса.

Биопрепарат вносят один раз в две недели в течение первого месяца очистки, а затем один раз в месяц до окончания срока проведения работ по очистке почвы.

В качестве комплексного минерального удобрения можно использовать, в частности, препарат «Нитроаммофоска», который содержит азот, фосфор и калий.

Добавка комплексного удобрения «Нитроаммофоски» позволяет увеличить степень очистки, так как присутствие компонентов биогенного питания – солей азота, фосфора и калия – обеспечивает наилучшие условия роста и окислительной активности бактериальных клеток.

Внесение комплексного минерального удобрения осуществляют либо после внесения биопрепарата в сухом виде, либо одновременно путем приготовления водной смеси, содержащей бактериальную суспензию и минеральное удобрение (например, «Нитроаммофоска»).

Количество вносимого удобрения определяют после заранее проведенного химического анализа почвы. При недостаточном содержании азота, фосфора и калия определяют нужное количество комплексного удобрения (из расчета на 1 м загрязненной территории).

Для нормального роста бактерий на 10 частей углерода требуется одна часть азота. Если это отношение больше, то рост бактерий и утилизация углеводородов происходит медленно. Кроме того, в загрязненной почве снижается содержание подвижного фосфора, а также калия.

Поэтому следует использовать комплексные минеральные удобрения. В данной работе предлагается применять удобрение «Нитроаммофоска» в количестве 20-200 г на 1 м² в зависимости от типа почв.

Внесение адсорбента может быть необязательным этапом технологии очистки нефтезагрязненных почвенных и водных поверхностей. Однако в случае применения древесных опилок бактериальные клетки распределяются по поверхности адсорбента, при этом увеличивается активность микробной популяции. Пористая поверхность древесных опилок накапливает в своих порах влагу и кислород, что увеличивает доступ воздуха и активирует процесс биодеструкции нефтепродуктов.

Проводят регулярное увлажнение обрабатываемой поверхности (1 раз в неделю) для поддержания влажности почвы на уровне 20-35% в зависимости от типа и структуры почвы.

После окончания рекультивационных работ проводится анализ остаточного содержания нефтепродуктов. В случае недостаточной степени очистки и превышения предельно допустимых концентраций для нефтепродуктов цикл работ по очистке территорий повторяется еще раз.

Работы по восстановлению загрязненных нефтью территорий в основном осуществляют в летний период (в том числе и в северных регионах), когда возможно проведение рекультивационных работ, а именно рыхление или вспашка почвы и дополнительное увлажнение.

Возможность осуществления предлагаемых изобретений подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Получение биопрепарата в жидком виде.

Для получения биомассы препарата можно проводить как совместное культивирование штаммов, входящих в состав биопрепарата, так и каждого микроорганизма по отдельности.

А) Для культивирования микроорганизмов-деструкторов Pseudomonas sp. BKM В-2387Д, Pseudomonas putida BKM В-2380Д, Rhodococcus sp. BKM Ас-2532Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д используют ферментеры типа БИОР-01 или БИОР-025 вместимостью 100-250 л с коэффициентом заполнения 0,6-0,7. Ферментеры оснащены фильтрами тонкой очистки воздуха, датчиками температуры, рН, скорости перемешивания и расхода воздуха на аэрацию.

Внесение посевного материала в ферментер производили исходя из соотношения 2 л микробной суспензии с концентрацией 2×10⁹-4×10⁹ клеток/мл на 60 л питательной среды.

Выращивание нативной культуры псевдомонад (штаммы Pseudomonas sp. BKM В-2387Д, Pseudomonas putida BKM В-2380Д) осуществляют в ферментере на питательной среде следующего состава:

Компоненты	Концентрация (г/л)
Кислотный гидролизат	10
казеина или пептон
Дрожжевой автолизат	70
К2НРO4	2
MgSO4	0,3
MnSO4	0,05
(NH4)2SO4	6
Глюкоза	20
Дизельное топливо	0,5
Софэксил	0,8 мл
Вода водопроводная	до 60 л (до 160 л)

рН среды – 6,8-7,0.

Поддерживают следующие значения технологических параметров процесса культивирования псевдомонад:

Величину рН поддерживают автоматически путем подачи 15%-ного раствора NH₄OH, при непрерывном перемешивании.

Продолжительность культивирования 18-20 часов. Процесс завершают после повышения уровня рН до 7,3.

Нативная культура псевдомонад должна отвечать следующим требованиям:

– оптическая плотность микробной суспензии – не менее 39 единиц (=540 нм);

– рН 7,3-7,4.

Выращивание нативной культуры родококков (штаммы Rhodococcus sp. ВКМ Ас-2532Д и Rhodococcus sp. BKM Ас-2533Д) осуществляют в ферментере на питательной среде следующего состава:

Компоненты	Концентрация (г/л)
Кислотный гидролизат казеина	10
или пептон
Дрожжевой автолизат	100 мл
К2НРO4	2
MgSO4	0,3
MnSO4	0,05
(NH4)2SO4	6
NaCl	0,5
Глюкоза	20
Дизельное топливо	0,5
Софэксил	1 мл
Вода водопроводная	до 60 л (до 160 л)

рН среды – 6,8-7,0.

Значения технологических параметров процесса культивирования поддерживают следующими:

Величину рН поддерживают автоматически путем подачи 15%-ного раствора NH₄OH, при непрерывном перемешивании.

Продолжительность процесса культивирования – 16-28 часов.

Выращенную нативную культуру как родококков, так и псевдомонад сепарируют. Сепарирование биомассы осуществляли на проточном сепараторе Сера Z-61 при скорости вращения ротора 16000 об/мин. Скорость сепарирования подбирают такой, чтобы проба фильтрата на выходе из сепаратора была визуально прозрачной.

Скорость подачи культуральной жидкости на сепаратор поддерживают в интервале 30-40 л/час.

Жидкую форму биопрепарата получают путем механического смешивания в равной пропорции концентрированной биомассы выращенных раздельно популяций псевдомонад и родококков.

Биопрепарат хранят в виде суспензии при температуре 4-6°С до 30 суток.

Б) Выращивание смешанной культуры родококков и псевдомонад.

Более перспективным является совместное культивирование культур в ферментере на питательной среде, приведенной выше для псевдомонад. Внесение посевного материала каждого штамма бактерий в ферментер производили исходя из соотношения 2 л микробной суспензии с концентрацией 2×10⁹-4×10⁹ клеток/мл на 60 л питательной среды. Сначала в ферментер засевают посевной материал родококков (штаммы Rhodococcus sp. BKM Ac-2532 и Rhodococcus sp. BKM Ac-2533), а посевной материал псевдомонад (штаммы Pseudomonas sp. BKM В-2387Д, Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д) вносят через 12 часов после начала процесса культивирования.

Выращенную нативную культуру сепарируют. Сепарирование биомассы осуществляли на проточном сепараторе Сера Z-61 при скорости вращения ротора 16000 об/мин. Скорость сепарирования подбирают такой, чтобы проба фильтрата на выходе из сепаратора была визуально прозрачной.

Скорость подачи культуральной жидкости на сепаратор поддерживают в интервале 30-40 л/час.

Полученная концентрированная биомасса бактерий представляет собой жидкую форму биопрепарата.

Биопрепарат хранят в виде суспензии при температуре 4-6°С до 30 суток.

Пример 2. Получение сухого биопрепарата.

В емкость с микробной биомассой, полученной, как это описано в примере 1А или 1Б, с соблюдением правил асептики, добавляют защитную среду: 10%-ный раствор сахарозы (приведена конечная концентрация) в соотношении 1:1. Тщательно перемешивают и оставляют на 24 часа при температуре 4-6°С.

Готовую бактериальную суспензию разливают в поддоны и замораживают при температуре минус 40°С в течение суток. Кюветы устанавливают в середине полок сушилки. По достижении рабочего вакуума, не превышающего 100 микрон, препарат должен быть охлажден до минус (30-35)°С и выдержан при указанной температуре в течение 45-60 минут. При высушивании препарата регулируют температуру на полках таким образом, чтобы достигнуть 0°С в препарате к 16-18 часу сушки, затем, повышая постепенно температуру, достигнуть +(27-30)°С в материале, при которой выдерживают препарат в течение 8-10 часов.

Длительность процесса высушивания составляет 24-28 часов.

Пример 2А. Способ получения препарата в сухой форме осуществляют аналогично описанному в примере 2, за исключением того, что добавляют защитную среду: 1%-ный раствор полиглюкина (приведена конечная концентрация) в соотношении 1:1,5.

Пример 3. Моделирование процесса биодеструкции нефти в лабораторных условиях.

Эксперимент проводили в лабораторных условиях (в микрокосмах) при температуре 18-25°С с интродукцией в образцы почвы, содержащие 2% нефти, ассоциации психротрофных штаммов-деструкторов Pseudomonas sp. ВКМ В-2387Д, Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д, Rhodococcus sp. BKM Ac-2532 и Rhodococcus sp. BKM Ac-2533. Периодически рыхлили почву для увеличения доступа кислорода и поливали для поддержания влажности на уровне 36-40%. Вносили комплексное удобрение «Нитроаммофоска» в количестве 2 г/кг почвы.

В результате проведенного нами модельного почвенного эксперимента установлено, что интродукция активной микробной ассоциации и внесение минерального удобрения ускоряют процесс биодеградации нефти.

Внесение комплексного азотно-фосфорно-калийного препарата («Нитроаммофоски») увеличивает степень деструкции нефти в два раза в микрокосме 2 (22%) по сравнению с контрольным микрокосмом 1 (13%) без внесения удобрения.

Сравнение степени деградации нефти в микрокосмах 2 (22%) и 4 (10%) с добавлением только удобрения и только микробной ассоциации соответственно (фиг.1) демонстрирует, что для успешной биодеградации нефти интродуцированными микроорганизмами-деструкторами необходимо одновременное внесение минеральных удобрений. Это было сделано в микрокосме 3, при этом степень деструкции нефти достигала 24%.

В почвенных микрокосмах во всех вариантах наблюдают снижение численности микроорганизмов в первые сутки, которое может быть обусловлено токсическим влиянием нефти и адаптацией микроорганизмов к условиям микрокосмов. Прослеживается общая тенденция к резкому увеличению численности как гетеротрофов, так и нефтедеструкторов в течение 21 суток эксперимента и постепенное снижение титра микроорганизмов на 1-1,5 порядка в течение последующих 63 суток.

Численность интродуцированных микроорганизмов-деструкторов в начале эксперимента составляет 1% и на протяжении всего эксперимента она варьирует от 17 до 61% от общей численности нефтедеструкторов, что демонстрирует их высокую конкурентоспособность в отношении аборигенных микроорганизмов.

Пример 4. Моделирование процесса очистки почвы в открытой окружающей среде.

Полевые испытания проводили на экспериментальном участке г.Пущине, Московской области. Уровень загрязнения почвы нефтью составлял 2,5%. Биоремедиацию (очистку) нефтезагрязненной почвы проводили по следующей схеме:

– рыхление почвы;

– интродукция рабочего раствора биопрепарата (в концентрации 1×10⁷-1×10⁸ КОЕ/мл) из расчета 10 л/м²;

– внесение комплексного минерального удобрения «Нитроаммофоска» из расчета 300 г/м²;

– периодическое увлажнение и рыхление почвы.

При проведении эксперимента температура воздуха варьировала от +21°С до -1°С, а почвы от +22°С до 0°С.

При проведении эксперимента установлено, что интродукция активной микробной ассоциации с внесением минерального удобрения является наиболее эффективным подходом для деградации нефти в почве. Степень деструкции нефти составляла 34% для вышеописанного случая. Удаление нефти за счет метаболической активности аборигенных микроорганизмов составляло 21% после двух месяцев проведения эксперимента (Табл.1).

Таким образом, создан эффективный способ очистки почв от загрязнения нефтью и нефтепродуктами в широком диапазоне температур окружающей среды (2-32°С), а также в условиях засоленности места загрязнения с использованием нового бактериального препарата.

Формула изобретения

1. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, включающий микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти бактерий рода Pseudomonas и рода Rhodococcus, отличающийся тем, что в качестве микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти из бактерий рода Pseudomonas он содержит психротрофные штаммы бактерий Pseudomonas sp.BKM В-2387Д, Pseudomonas putida BKM В-2380Д, а из бактерий рода Rhodococcus – психротрофные штаммы бактерий Rhodococcus sp.BKM Ас-2532Д и Rhodococcus sp.BKM Ас-2533Д в равных соотношениях для жидкой формы и сухой формы биопрепарата, а также дополнительно для сухой формы биопрепарата – защитную среду при соотношении биомасса : защитная среда, равном 1:(1-1,5).

2. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что защитная среда содержит вещества, выбранные из ряда: 3-10%-ный раствор сахарозы, 1-3%-ный раствор тиомочевины, 1-2%-ный раствор полиглюкина или любую их смесь.

3. Способ получения биопрепарата по п.1 для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, включающий глубинное культивирование смешанной бактериальной ассоциации штаммов бактерий Pseudomonas sp.BKM В-2387Д, Pseudomonas putida BKM В-2380Д, Rhodococcus sp.BKM Ас-2532Д и Rhodococcus sp.BKM Ас-2533Д на полусинтетической питательной среде.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что дополнительно для получения препарата в сухой форме после культивирования в полученную суспензию микроорганизмов вносят защитную среду в соотношении биомасса микроорганизмов : защитная среда 1:1-1,5, затем замораживают и лиофильно высушивают.

5. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, включающий внесение биопрепарата в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и фиторемедиаций путем засева смесью однолетних и многолетних трав, отличающийся тем, что вносят рабочий раствор биопрепарата по п.1 из расчета 10 л/м² в концентрации 1·10⁷-1·10⁸ КОЕ/мл и комплексное минеральное удобрение «Нитроаммофоска» в концентрации 20-200 г/м².

РИСУНКИ

PC4A – Регистрация договора об уступке патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

Прежний патентообладатель:

Филонов Андрей Евгеньевич,
Шкидченко Александр Николаевич,
Боронин Александр Михайлович

(73) Патентообладатель:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (ИБФМ РАН)

Договор № РД0067121 зарегистрирован 15.07.2010

Извещение опубликовано: 27.08.2010 БИ: 24/2010