Патент на изобретение №2378012
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬГИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БЛЮТАНГА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области биотехнологии. Вакцина содержит культуральное вирусное сырье, инактивант и масляный адъювант. В качестве вирусного сырья вакцина содержит моно- или поливарианты серотипов вируса блютанга, вызвавшие эпизоотию, размноженные в элективных культурах клеток с биологической активностью 5,5-8,0 lg ТЦД50/см3, при следующем содержании компонентов в вакцине, мас.%: культуральное сырье вируса блютанга – 40-60, инактивант-теотропин – 0,02-0,05, масляный адъювант – остальное. Вакцина безвредна, обладает высокой иммуногенностью.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к производству и применению биологических препаратов для специфической профилактики блютанга. Одним из наиболее сложных вопросов в системе противоэпизоотических мероприятий при блютанге является специфическая профилактика болезни. Следует отметить, что переболевшие овцы приобретают пожизненный иммунитет только к одному серотипу вируса, который вызвал болезнь. В настоящее же время известны 24 серотипа вируса, которые вызывают сходную клиническую картину при заражении восприимчивых животных. В России разработана инактивированная вакцина на основе 16-го серотипа вируса, которая была успешно применена в Бурятии при ликвидации вспышек блютанга в 1993 году [1]. Известна вакцина, применяемая для вакцинации овец, содержащая инактивированный 0,05% теотропином вирус, выращенный в однослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК) или почки сирийского хомячка ВНК-21, и масляный адъювант, состоящий из 80% минерального масла и 20% эмульгатора КЛ-230, который добавляется к инактивированному вирусному сырью в объеме 20%. Моновакцина производится из 16 серотипа вируса блютанга. Бивалентная вакцина разработана против блютанга 4 и 9 серотипов [2]. Однако вероятность возникновения этой болезни, вызванной другими серотипами, а также несколькими серотипами в пределах одной территории, достаточно высокая. Так, в настоящее время заболевание крупного рогатого скота (КРС) и овец в Европе обусловлено в основном 8 серотипом и 1 серотипом и представляет серьезную опасность заноса возбудителя этой болезни в нашу страну в связи с закупками КРС. Недостатком разработанных инактивированных моно- и бивалентных вакцин является то, что они не могут защитить от заболевания блютангом, вызванным другими серотипами вируса. Также в связи с осложнившейся ситуацией, а именно заболеванием блютангом КРС, необходима вакцина, используемая для прививки как овец, так и КРС. Использование эмульгатора КЛ-230 в количестве 20% требует значительного расхода антигенсодержащего сырья – до 80% от общего состава вакцины. Целью настоящего изобретения является разработка инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга из одного или нескольких серотипов, сокращающей расход вирусного сырья и применяемой для вакцинации крупного и мелкого рогатого скота. Указанная цель достигается тем, что инактивированная вакцина в качестве вирусного сырья содержит моно – или поливарианты серотипов вируса блютанга, вызвавшие эпизоотию, размноженные в элективных культурах клеток с биологической активностью 5,5-8,0 lg ТЦД50/см3, при следующем содержании компонентов в вакцине, мас.%:
Инактивированная вакцина против блютанга создает иммунитет после двукратной прививки животных на 21 сутки после второй вакцинации длительностью не менее 9 месяцев. По иммуногенности и безвредности вакцина не уступает другим, применяемым при этой болезни вакцинам и стабильна при хранении. По иммуногенности и безвредности инактивированная вакцина из одного или нескольких серотипов вируса блютанга не уступает моновакцинам, применяемым при этих болезнях [2] и стабильна при хранении (табл.1). Предлагаемый состав вакцины позволяет в 2 раза снизить расход вируссодержащего сырья за счет внесения в состав вакцины масляного адъюванта в указанном ниже соотношении, а изготовление вакцины непосредственно из эпизоотического изолята позволяет значительно сократить сроки изготовления вакцины.
Приводим примеры, содержащие компоненты в конкретных соотношениях на 100 л вакцины. Пример 1 Получение инактивированного кулътуралъного вируссодержащего сырья из эпизоотического изолята вируса блютанга Эпизоотический изолят вируса блютанга выделяют из поступившего патматериала от больных и павших животных во время вспышки заболевания, из которого приготовляют 10% суспензию. Этой суспензией заражают элективную клеточную культуру ПСГК-60, ВНК-21 или Vero и культивируют при 37°С до 6 суток. Затем инфицированную культуру клеток замораживают-оттаивают и делают следующий пассаж до проявления цитопатических изменений. После 2-3-х пассажей в культуре клеток определяют инфекционную активность, определяют серотип выделенного изолята, паспортизируют и хранят при – 40°С. Идентификацию выделенного вируса проводят в РДП, РСК и ТФ ИФА. Типирование выделенного вируса по индексу его нейтрализации в культуральном вируссодержащем материале сыворотками, специфичными к 24 серотипам вируса блютанга, двум серотипам вируса ЭГБО и вирусу болезни Ибараки. Для получения культурального вируссодержащего сырья готовят 2-3-суточную культуру клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-60 в роллерных бутылях, заражают определенным серотипом вируса блютанга с множественностью 0,010-0,001 ТЦД50/клетка и инкубируют при 37°С в течение 48-72 часов до проявления характерных цитопатических изменений и поражении 90-100% клеточного монослоя. Затем содержимое бутылей объединяют и определяют инфекционность вирусного материала титрованием в культуре клеток. Затем к вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 105,5 lg ТЦД50/см3 вносят теотропин, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37°С 48 ч. К полученному таким образом инактивированному сырью добавляют масляный адъювант – остальное до 100%, тщательно перемешивают, пропускают через коллоидную мельницу для эмульгирования и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета. Содержание антигена в вакцине составляет 50% при одинаковой иммуногенной активности с моновакциной против 16 серотипа, содержащей 80% антигена (таблица). Вакцину вводят по 1,5 см3 подкожно 4 овцам или по 3 см3 нетелям в область внутренней поверхности бедра, дважды с интервалом 14 сут. До иммунизации и через 21 день после второй вакцинации от животных отбирают кровь и сыворотку исследуют на наличие вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации. рН проводят по стандартной методике со 100-300 ТЦД50 вируса гомологичного серотипа в пробирках или микрометодом в планшетах (разведение сывороток с 1:2 до 1:128), с использованием культуры клеток ПСГК-60 или CV-1 (Vero или ВНК-21). Вакцина вызывала образование ВН-антител у испытуемых животных в титрах 1:8-1:16. Вакцину считают иммуногенной, если она индуцирует образование вируснейтрализующих антител в исследуемых сыворотках крови вакцинированных животных в титре не ниже 1:4 против гомологичного серотипа вируса, включенного в состав вакцины. Пример 2 Получение инактивированного культуралъного вируссодержащего сырья из двух серотипов вируса блютанга Для получения производственного вируса суспензионные клетки ВНК-21/13 (посевная концентрация клеток 300-500 тыс/см3) в среде 0,25 ФГМ-С на солевом растворе Эрла помещают в реактор (10-500 дм3) и выращивают при (37,0±0,5)°С и постоянном перемешивании в течение 2-3 сут до увеличения клеточной концентрации до (1-2)×106 кл/см3. Затем суспензию клеток ВНК-21/13 указанной концентрации заражают вирусом блютанга: 1 реактор вирусом 4-го серотипа, а 2-й реактор – вирусом 8-го серотипа и инкубируют при температуре 37,0°С. В течение 48-72 ч отбирают пробы на определение жизнеспособности клеток в суспензии, затем производят подсчет в камере Горяева после окрашивания 0,5% водным раствором трипанового синего по общепринятой методике. При обнаружении (80±10,0) % нежизнеспособных клеток культивирование прекращают и отбирают пробы вируса для определения наличия контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и инфекционной активности. Полученное таким образом культуральное вируссодержащее сырье двух серотипов вируса блютанга с исходной биологической активностью 105,5-108,0 lg ТЦД50/см3, инактивируют теотропином, объединяют и добавляют масляный адъювант – остальное, тщательно перемешивают и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета. Вакцину вводят по 3,0 см3 подкожно 4 нетелям (КРС) в область внутренней поверхности бедра, дважды с интервалом 14 сут. До иммунизации и через 21 день после второй вакцинации от животных отбирают кровь и сыворотку исследуют на наличие вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации. рН проводят по стандартной методике со 100-300 ТЦД50 вируса гомологичного серотипа в пробирках или микрометодом в планшетах (разведение сывороток с 1:2 до 1:128) с использованием культуры клеток ПСГК-60 или CV-1 (Vero или ВНК-21). Вакцина индуцировала образование вируснейтрализующих антител в крови вакцинированных животных в титре не ниже 1:8-1:16 против 4 и 8 серотипов вируса, включенного в состав вакцины соответственно. Пример 3 Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья из трех серотипов вируса блютанга Для получения производственного вируса суспензионные клетки ПСГК-с60 (посевная концентрация клеток 300-500 тыс./см3) в среде 0,25 ФГМ-С на солевом растворе Эрла помещают в реактор (10-500 дм3) и выращивают при (37,0±0,5)°С и постоянном перемешивании в течение 2-3 сут до увеличения клеточной концентрации в (1-2)×106кл/ см3. Затем суспензию клеток указанной концентрации заражают вирусом блютанга: 1-й реактор вирусом 4-го серотипа, 2-й реактор – вирусом 8-го серотипа и 3-й – вирусом 9-го серотипа и инкубируют при температуре 37,0°С. В течение 48-72 ч отбирают пробы на определение жизнеспособности клеток в суспензии, затем производят подсчет в камере Горяева после окрашивания 0,5% водным раствором трипанового синего по общепринятой методике. При обнаружении (80±10,0)% нежизнеспособных клеток культивирование прекращают и отбирают пробы вируса для определения наличия контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и инфекционной активности. Полученное таким образом культуральное вируссодержащее сырье трех серотипов вируса блютанга с исходной биологической активностью 105,5-108,0 lg ТЦД50/см3 инактивируют теотропином, добавляют масляный адъювант – остальное до 100 мас.%, тщательно перемешивают и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета. Вакцину вводят по 2,0 см3 подкожно 4 нетелям (КРС) в область внутренней поверхности бедра, дважды с интервалом 14 сут. До иммунизации и через 21 день после второй вакцинации от животных отбирают кровь и сыворотку исследуют на наличие вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации. рН проводят по стандартной методике со 100-300 ТЦД50 вируса гомологичного серотипа в пробирках или микрометодом в планшетах (разведение сывороток с 1:2 до 1:128) с использованием культуры клеток ПСГК-60, CV-1, ВНК-21 или Vero. Вакцину считают иммуногенной, если она индуцирует образование вируснейтрализующих антител в исследуемых сыворотках крови вакцинированных животных в титре не ниже 1:2-1:4 против гомологичного серотипа вируса, включенного в состав вакцины. Источники информации 1. Патент 2. Сливко В.А. Усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против блютанга, канд. диссерт., 2003 г.
Формула изобретения
Вакцина против блютанга, включающая культуральное вирусное сырье, инактивант и масляный адъювант, отличающаяся тем, что в качестве вирусного сырья содержит моно- или поливарианты серотипов вируса блютанга, вызвавшие эпизоотию, размноженные в элективных культурах клеток с биологической активностью 5,5-8,0 lg ТЦД50/см3, при следующем содержании компонентов в вакцине, мас.%:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2077583, 20.04.97 г., авторы Вишняков И.Ф., Стрижаков А.А., Новикова М.Б., Луницин А.В., Куриннов В.В., Карпов Г.М., Балышева В.И.