Патент на изобретение №2377992

(54) ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНОГО ФЕНОТИАЗИНА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ПОТЕРИ СЛУХА

(57) Реферат:

Настоящее изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается применения производного фенотиазина для получения лекарственного средства для профилактики и/или лечения потери слуха. Средство обеспечивает высокую эффективность лечения. 19 з.п. ф-лы, 9 ил.

Настоящее изобретение относится к применению производного фенотиазина, обладающего активностью, ингибирующей кальпаин, и активностью, задерживающей активные формы кислорода (ROS), для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения потери слуха. Также изобретение относится к продукту, содержащему по меньшей мере одно такое соединение, и к содержащей его фармацевтической композиции.

Среди множества причин потери слуха можно отметить, в частности, заболевания, такие как менингит или отит, генетические причины, повреждения, опухоли, лекарственные средства, при введении таких лекарственных средств, как некоторые антибиотики, противоопухолевые лекарственные средства, нестероидные противовоспалительные средства, диуретики, лекарственные средства при язве или противосудорожные средства, продолжительное воздействие ароматических органических растворителей, таких как толуол или ксилол, старение и воздействие шума. Главными причинами потери слуха являются пресбиакузис (связанная с возрастом глухота), продолжительное воздействие шума и введение лекарственных средств.

В настоящее время хорошо известно, что используемые в лечении тяжелых инфекций некоторые антибиотики семейства аминогликозидов, такие как гентамицин и тобрамицин, ответственны за улитковую глухоту. Токсичность аминозидов (аминогликозидов, таких как амикацин, дибекацин, гентамицин, изепамицин, нетилмицин, спектиномицин, тобрамицин) исходно проявляет себя снижением слуха при высоких частотах и сначала не распознается пациентом. Это только постепенно начинает беспокоить последнего. К сожалению, это зачастую необратимо.

Окружающий шум снижает слуховую способность. Вызываемая шумом потеря слуха происходит, когда волосковые сенсорные клетки, проводящие звук к внутреннему уху, повреждаются и не могут больше заставлять слуховой нерв посылать электрические импульсы к головному мозгу.

Двумя главными факторами, влияющими на потерю слуха, являются громкость звука и продолжительность воздействия. Хотя реакция на воздействие шума различается от одного индивидуума к другому, можно достоверно указать некоторые факты. В исследовании было показано, что продолжительное воздействие 85 децибел (дБ) или более с течением времени вызывает постоянную потерю слуха.

Европейская и североамериканская статистика показывает, что от 8 до 10% популяции страдает улитковыми патологиями (глухотой, шумом в ушах). Подвергаясь уровням звука, производимого на дискотеках, техноконцертах, а также плейерами, формируется целое поколение людей, которые являются глухими и страдают шумом в ушах. Таким образом, связанные с возрастом проблемы (пресбиакузис), в настоящее время начинающиеся приблизительно в возрасте 60 лет, могут начинаться значительно раньше, т.е. приблизительно в возрасте 35-40 лет.

Проблема с патологиями слуха состоит в том, что значительное большинство их происходит в результате гибели волосковых сенсорных клеток и нейронов внутреннего уха (или улитки). После стадии развития, преимущественно являющейся внутриутробной, эти клетки не обладают способностью к самовоспроизведению после последней стадии их дифференцировки.

Даже в настоящее время прогрессирующая утрата чувствительной и нервной способностей уха, связанная с различными улитковыми патологиями, находится вне возможностей какого-либо лечения.

Таким образом, предмет изобретения относится к применению гетероциклического производного, соответствующего формуле (I)

в форме диастереоизомеров или любых сочетаний этих форм,

где R представляет собой атом водорода, (C₁-C₆) алкил, арилалкил или радикал -C(O)R’

где R’ представляет собой гетероциклоалкил, (C₁-C₆) алкил, арил или аралкильный радикал;

алкильный, арильный или гетероциклоалкильный радикалы, необязательно, замещены одним или несколькими идентичными или различными заместителями, выбранными из: (C₁-C₆) алкила, гидрокси, (C₁-C₆) алкокси, нитро, циано, галогена или -NR₁R₂;

R₁ и R₂ представляют собой, независимо, атом водорода или (C₁-C₆) алкильный радикал, или R₁ и R₂ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, формируют необязательно замещенный гетероцикл,

для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения потери слуха.

В настоящей заявке под травмой подразумевают группу вызываемых внешним фактором местных повреждений, затрагивающих ткани и органы. В случае акустической травмы внешний фактор, в основном, представляет собой шум.

Под (C₁-C₆) алкилом подразумевают линейный или разветвленный алкильный радикал, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, такой как, например, радикал метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил, пентил, неопентил, изопентил, гексил, изогексил. Указанным выше алкильным радикалам могут соответствовать радикалы (C₁-C₆) алкокси, такие как, например, метокси-, этокси-, пропилокси- или изопропилокси-радикалы, а также линейные, вторичные или третичные бутоксирадикалы. Указанным выше алкильным радикалам могут соответствовать алкилкарбонильные радикалы, такие как, например, метилкарбонил, этилкарбонил, пропилкарбонил. Под галогеном подразумевают атомы фтора, хлора, брома или йода.

Под арилом подразумевают карбоциклическую или гетероциклическую систему, содержащую по меньшей мере одно ароматическое кольцо, где систему называют гетероциклической, если по меньшей мере одно из колец, из которых она состоит, содержит гетероатом (O, N или S). В качестве примера карбоциклического арильного радикала можно указать фенил или нафтил. В качестве примера гетероциклического арильного (или гетероарильного) радикала можно указать тиенил, фурил, пирролил, имидазолил, пиразолил, изотиазолил, тиазолил, изоксазолил, оксазолил, пиридил, пиразинил, пиримидил, бензотиенил, бензофурил и индолил.

Предпочтительно термин гетероцикл (или гетероциклоалкил) обозначает насыщенный или ненасыщенный моно- или бициклический гетероцикл, содержащий от 1 до 5 гетероатомов, выбранных из O, S и N. Атом азота может, необязательно, быть замещенным радикалом, выбранным из: алкила, арила, аралкила и алкилкарбонила. В качестве примера насыщенного гетероцикла можно указать: тетрагидрофуран, тетрагидропиран, оксетан, оксепан, тетрагидротиофен, тетрагидротиопиран, тиетан, пирролидин, пиперидин, азетидин, 1,3-диоксан, 1,3-диоксолан, 1,3-дитиолан, 1,3-дитиан, 1,3-оксатиолан, 1,3-оксазолидин, 1,3-имидазолидин или 1,3-тиазолидин. В качестве примера ненасыщенного гетероцикла можно указать: дигидротиофен, дигидрофуран, дигидропиррол, дигидроимидазол, дигидропиразол, дигидропиридин, индолин.

Арилалкильные (или аралкильные) радикалы обозначают радикалы, в которых арильные и алкильные радикалы соответственно представляют собой радикалы, как указано выше, такие как, например, бензил, фенетил или нафтилметил.

В случае радикала с формулой -NR₁R₂, где R₁ и R₂ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, формируют необязательно замещенный гетероцикл, гетероцикл предпочтительно насыщен и содержит от 4 до 7 членов, а также от 1 до 3 гетероатомов, в том числе уже присутствующий атом азота, где дополнительные гетероатомы независимо выбирают из группы, состоящей из атомов O, N и S. Указанный гетероцикл может представлять собой, например, азетидиновое, пирролидиновое, пиперидиновое, пиперазиновое, морфолиновое или тиоморфолиновое кольцо. Указанный гетероцикл может быть замещен одним или несколькими аналогичными или различными заместителями, выбранными из гидрокси-группы, алкильного, арильного, аралкильного или алкоксирадикала, или атома галогена.

Более конкретно, предмет изобретения относится к применению, как указано выше, отличающемуся тем, что R представляет собой -C(O)R’, а R’ предпочтительно представляет собой алкильный радикал.

Очень предпочтительно соединение (I) характеризуется тем, что R представляет собой -C(O)-CH₃. Последнее соединение далее обозначено как соединение (1).

Более конкретно, предмет изобретения относится к применению, как указано выше, отличающемуся тем, что R представляет собой водород.

Также очень предпочтительно, соединение (I), как указано выше, имеет формулу

а более конкретно одну из следующих формул:

Также очень предпочтительно соединение (I), как указано выше, имеет формулу

а более конкретно

Соединения, как указано выше, представляют собой защитные средства, сочетающие противоокислительный и антикальпаиновый эффекты, и описаны в заявке WO 01/32654.

Таким образом, предмет настоящего изобретения также относится к применению соединения с формулой (I), как указано выше, в предварительном или последующем лечении, связанном с причиной потери слуха.

Также предмет настоящего изобретения относится к применению соединения с формулой (I), как указано выше, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения потери слуха вследствие введения другого лекарственного средства. Предпочтительно другое лекарственное средство представляет собой антибиотик, такой как гентамицин, противоопухолевое лекарственное средство, такое как цисплатин, нестероидное противовоспалительное средство, такое как производные салициловой кислоты или ибупрофен, диуретик, такой как фуросемид, противоязвенное средство, такое как циметидин или омепразол, противосудорожное средство, такое как карбамазепин или вальпроевая кислота. Очень предпочтительно другое лекарственное средство представляет собой антибиотик, а более конкретно гентамицин.

Также предмет настоящего изобретения относится к применению соединения с формулой (I), как указано выше, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения потери слуха вследствие пресбиакузиса.

Также предмет настоящего изобретения относится к применению соединения с формулой (I), как указано выше, для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения потери слуха вследствие акустической травмы.

Соединения по изобретению можно использовать по отдельности или в сочетании по меньшей мере с одним дополнительным веществом, обладающим фармацевтической активностью, предпочтительно веществом, эффективным для профилактики и/или лечения потери слуха, или для профилактики и/или лечения любых патологий, связанных с потерей слуха.

Соединения можно сочетать с антиоксидантами, ингибиторами кальпаина, такими как леупептин или Neurodur, периферическими сосудорасширяющими средствами, такими как EGb 761^®, агонистами или антагонистами рецептора NMDA, пептидными ингибиторами N-концевой киназы c-Jun, такими как D-JNK-1.

Также предмет изобретения относится к применению, как указано выше, отличающемуся тем, что его сочетают по меньшей мере с одним другим веществом с фармацевтической активностью, а предпочтительно с веществом, которое выбирают из: антиоксидантов, ингибиторов кальпаина, периферических сосудорасширяющих средств, агонистов или антагонистов рецептора NMDA, пептидных ингибиторов N-концевой киназы c-Jun.

Соединение с формулой (I) и предпочтительно соединение (1), как указано выше, можно вводить местно в дозе, составляющей от 50 до 500 мкМ. В случае местного внутриулиткового лечения их можно вводить в дозе, составляющей от 50 до 200 мкМ. В случае местного внеулиткового лечения их можно вводить в дозе, составляющей от 200 до 500 мкМ. Известные в фармакологии вещества, которые, необязательно, сочетают с ними, вводят в обычных рекомендуемых дозах.

Соединения, как указано выше, а также вещества с фармацевтической активностью, которые, необязательно, сочетают с ними, можно вводить общепринятыми способами введения, такими как пероральное, внутрибрюшинное, подкожное или внутривенное. Их можно вводить одновременно или раздельно, теми же или отличными способами введения. Предпочтительно соединение (I), как указано выше, вводят местно способами, общепринятыми в лечении внутреннего уха, такими как микрокатетеры, шприцы для чрезбарабанной инъекции или трубки, снабженные тампоном типа Silverstein Microwick.

Также предмет изобретения относится к продукту, содержащему гетероциклическое производное с формулой (I), как указано выше, в форме диастереоизомеров или любых сочетаний этих форм, и по меньшей мере одно вещество с терапевтической активностью, в качестве комбинированного продукта для применения, являющегося одновременным, раздельным или распределенным в течение времени, для профилактики и/или лечения потери слуха. Предпочтительно предмет изобретения относится к продукту, как указано выше, для профилактики и/или лечения потери слуха после введения лекарственного средства или после пресбиакузиса, или после акустической травмы.

Наконец, предмет изобретения относится к использованию продукта, как указано выше, в качестве лекарственного средства.

В случае потери слуха после введения лекарственного средства последнее предпочтительно представляет собой антибиотик, а предпочтительно гентамицин.

Вещества с фармацевтической активностью, с которыми их, необязательно, сочетают, вводят посредством способов введения, обычно предусматриваемых для этих веществ в рассматриваемой терапевтической области.

В случае потери слуха, вызываемой акустической травмой, введение соединения (I), как указано выше, можно проводить за несколько суток до акустической травмы, предпочтительно – от 2 до 3 суток до травмы, и через 24 часа после травмы. Предпочтительно введение проводят в течение 7 суток после травмы. Также предпочтительно это введение можно проводить в течение 2 часов после травмы.

Таким образом, предмет изобретения относится к описанному выше применению, характеризующемуся тем, что соединение (1) в форме диастереоизомеров или любого сочетания этих форм вводят в течение 7 часов, а предпочтительно – в течение часа после травмы.

В экспериментальной части представлены результаты, отражающие терапевтическую эффективность соединения (1) в отношении функционального восстановления после акустической травмы.

Следующие примеры представлены для иллюстрации указанных выше процедур и ни в каком случае не предназначены для ограничения объема изобретения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ:

Фармакологическое исследование

1) Индуцируемая обработкой гентамицином ототоксичность

Проявление защитного эффекта соединения 1, вводимого в качестве сопутствующего лечения, в отношении индуцируемой гентамицином гибели волосковых сенсорных клеток.

Было показано, что гентамицин и другие аминогликозиды вызывают повреждение волосковых сенсорных клеток и потерю слуха у человека. У полосатого данио органы чувств, называемые невромастами, расположены на поверхности тела. У этих рыб волосковые сенсорные клетки невромастов можно окрашивать посредством DASPEI, и это окрашивание отражает количество волосковых сенсорных клеток. Эти волосковые сенсорные клетки структурно и функционально сходны с внутренними волосковыми сенсорными клетками уха человека.

Повреждение внутренних волосковых сенсорных клеток у полосатого данио индуцируют гентамицином. Для проверки эффекта соединения (1) на защиту поврежденных гентамицином волосковых сенсорных клеток вводили соединение (1) в качестве сопутствующего лечения с гентамицином. Затем внутренние волосковые сенсорные клетки окрашивают и подсчитывают.

Исследование проводят на рыбах в возрасте 5 суток, инкубируемых в течение 24 часов с 1 мкг/мл гентамицина при наличии или отсутствии соединения (1). Параллельно выполняют контрольные исследования; отдельно индифферентное вещество (1% DMSO; положительный контроль). Отрицательный контроль представляют собой рыбы, обрабатываемые гентамицином.

Для получения изображения волосковых сенсорных клеток in vivo проводят окрашивание посредством DASPEI (йодида 2,4-диметиламиностирил-N-этилпиридиния) (n=5 в группе). Для количественного определения сигнала окрашивания волосковых сенсорных клеток используют морфометрический анализ. В качестве 100% принимали сигнал при окрашивании DASPEI положительных контролей.

Результаты представлены на фиг.1 (процент окрашенных DASPEI волосковых сенсорных клеток. Положительный контроль (полосатого данио – 1% DMSO); отрицательный контроль (полосатого данио – 1% DMSO – гентамицин 1 мкг/мл) и эффект продукта (полосатого данио – 1% DMSO – гентамицин – соединение 1). Эксперимент выполняли на 5 животных в каждой группе).

Результаты на фиг.1 показывают, что:

– сигнал окрашивания отрицательного контроля представляет собой 31,5±4,2% контрольного сигнала, или гибель 68,5±4,9% волосковых сенсорных клеток после обработки гентамицином;

– сигнал окрашивания животных, обрабатываемых гентамицином и соединением 1, представляет собой 65,2±4,4% контрольного сигнала, или высокозначимую защиту 48,7±2,63% поврежденных обработкой гентамицином волосковых сенсорных клеток.

2) Потеря слуха после акустической травмы

Проводилось исследование защитного действия соединения (1) при предварительной и последующей обработке, в отношении защиты волосковых сенсорных клеток внутреннего уха, с одной стороны, и функционального восстановления слуха, с другой стороны, у морских свинок после вызываемой акустической травмой потери слуха. Соединение (1) вводили местно способом интра- и экстракохлеарно так, чтобы стимулировать его использование в хирургической клинической медицине для человека.

Достигаемое посредством этого нового защитного средства функциональное восстановление количественно определяли с использованием функционального теста, представляющего собой считывание аудиограммы животных. Эту аудиограмму получают регистрацией активности суммарного потенциала действия слухового нерва. Аудиограммы регистрируют до и после акустической травмы. Завершают эти функциональные данные анализы посредством сканирующей электронной микроскопии для исследования гибели клеток на протяжении спирали улитки, а также защитного эффекта соединения (1).

Все эксперименты выполняют на морских свинках; каждый эксперимент выполняют согласно сходной схеме.

Общая схема экспериментальной стадии представляет собой следующую:

– животных обезболивают внутримышечной инъекцией смеси Rompun^® при 2% (3 мг/кг)+Zoletil^® (40 мг/кг). Это обезболивание имеет преимущество быстрого исчезновения, и его можно поддерживать в течение нескольких часов регулярной инъекцией (каждые 2 часа) трети первоначальной дозы;

– помещение электродов и минипомпы согласно фиг.2.

Улитку достигают посредством дореального доступа. После бритья и очистки кожи черепа делают разрез 2 см за ушной раковиной. Отворачивают слои околоушной железы и мышц, покрывающие барабанный пузырь. Высушенную и очищенную кость прокалывают в ее верхней части стенки ниже выхода лицевого нерва. Затем в пузырь вводят активный электрод (платиновую проволоку диаметром 0,13 мм, покрытую тефлоном) и помещают в контакт с мембраной круглого окна под контролем операционного микроскопа (WILD M650). После регистрации показателей слуховых порогов ручным способом просверливают небольшое отверстие диаметром 0,2 мм в нижнем изгибе барабанного канала непосредственно под круглым окном.

Используя второй микроманипулятор, в улитку вставляют стеклянную пипетку (диаметром 0,1 мм в конечной части), соединенную с микропомпой посредством катетера. Барабанный пузырь, в том числе регистрирующий электрод и пипетку для перфузии, закрывают используемой в стоматологии пластмассой.

Микропомпу перемещают под кожу животного, мышечный и кожный слои промывают тампоном с бетадином, сшивают рассасывающимися швами и покрывают раствором антибиотика (рифоцин 5P100^®).

Затем на верхушечной точке делают второй разрез, приблизительно 1,5 см, с целью закрепления соединительного устройства (Connectral, ссылка: 8/45-05,050,000) на черепе животного. После удаления надкостницы кости эту область осторожно сушат, промывают тампоном с нитратом серебра, а затем покрывают пленкой цианолита.

Электроды (активный и сравнения) перемещают под кожу к соединительному устройству, к которому они присоединены. Затем соединительное устройство закрепляют на черепе используемой в стоматологии пластмассой.

Способы стимуляции

Стимуляции звуком осуществляют с использованием двух синтезаторов Hewlett Packard (HP 3314 A и HP 8904 A) и передают в свободное поле посредством громкоговорителя (JBL 075), расположенного в 10 см от уха. Калибровку акустической системы проводят на искусственном ухе с использованием микрофона 0,5 дюймов (тип 4134, Bruel и Kjaer) и измерительного усилителя (тип 2606), позволяющего прямое считывание уровня звука в децибелах SPL (дБ SPL, ссылка: 2,10-5 Pa). Для отображения акустических сигналов устройство вывода измерительного усилителя подключают к осциллографу. Животных в течение 30 минут подвергают воздействию звука 6 кГц при 120 дБ SPL.

Способы регистрации:

Ответные реакции улитки, которые регистрируют электродом, имплантированным в улитку посредством прикрепленного к голове животного соединительного устройства, усиливают (коэффициент усиления 1000) и фильтруют (32 Гц – 3200 Гц) с использованием предварительного усилителя и дифференциального усилителя типа GRASS P 511 К. Непосредственная кривая отображается на осциллографе (Tektronix тип 513). Этот сигнал усредняют (256 проходов) для снижения фонового шума и сохраняют на компьютер 486 PC, 66 мегагерц (Hewlett-Packard-Vectra 05/65). Пороговый критерий определяют как представляющий собой величину в дБ SPL, необходимую для получения измеримой ответной реакции (>2 мкВ). Два электрода, приведенные в контакт с улиткой (круглым окном), позволяют регистрировать ответные реакции улитки и получать аудиограммы для каждого уха. Показатели слуховых порогов регистрируют через 20 минут после звуковой травмы и каждые сутки в течение одного месяца.

Вовлечение активации кальпаина после акустической травмы:

Для определения активации фермента кальпаина после акустической травмы количественно определяют расщепление специфического субстрата кальпаина, фодрина. Кальпаин расщепляет фодрин 240 кДа, образуя продукт деградации 150 кДа. Посредством поликлонального антитела, специфичного к фрагменту 150 кДа, и антитела к кальбиндину проводят двойное мечение, позволяющее выявлять волосковые сенсорные клетки. Флуоресценцию выявляют посредством конфокального микроскопа.

Молекулярные механизмы гибели волосковых сенсорных клеток после акустической травмы:

Для определения природы гибели клеток количественно определяют фрагментацию ДНК клеток улитки с использованием способа TUNEL.

Определение целостности волосковых сенсорных клеток после акустической травмы:

Целостность клеток улитки определяют иммуноцитохимией с использованием антитела к цитохрому C. В здоровых клетках цитохром C расположен в митохондриях. После акустической травмы цитохром C рассеян и распределен по цитоплазме.

Фаза 1: Проявление защитного эффекта соединения (1), вводимого в качестве предварительного лечения, в отношении вызываемых травмой потери слуха и гибели клеток на протяжении спирали улитки

Протокол – фаза 1: предварительное введение соединения (1)

Соединение (1) доставляют осмотической минипомпой, помещаемой под кожу.

Через двое суток после имплантации минипомпы животных посредством катетера (внутриулитковой инфузии) подвергают звуковой травме внутренней части улитки.

Этот эксперимент выполняют на 7 животных, а затем на 30 животных на предмет дозо-зависимого ответа.

Соединение (1) вводят непосредственно в улитку (внутриулитковая интракохлеарная перфузия) через осмотическую минипомпу (объемная скорость потока 1 мкл/час, объем 200 мкл, продолжительность диффузии 7 суток), на постоянной основе имплантированную в улитку за 2 суток перед травмой. Этот способ позволяет определять защитный эффект соединения (1), в дозе 100 мкМ, в отношении вызываемой травмой гибели клеток на протяжении спирали улитки, а также функционального восстановления слуха. После этого эффект дозы продукта позволяет определять эффективную дозу, делающую возможным сохранение 50% слуха.

Результаты фазы 1

Соединение (1) в концентрации 100 мкМ.

Измеряемый аудиограммой функциональный тест.Потеря слуха после акустической травмы и защита посредством соединения 1.

Считывание аудиограмм через пять суток после травмы посредством 120 дБ в течение периода 30 минут позволяет выявлять эффективность соединения (1); этот продукт делает возможным восстановление 100% способности слышать (фиг.3) в случае его перфузии при 100 мкМ за 2 суток перед травмой.

Морфологическое исследование: гистология клеток на протяжении спирали улитки после акустической травмы. Защита посредством соединения (1).

По окончании электрофизиологической оценки (аудиограммы), через 30 суток после акустической травмы, отбирают образцы улиток животных и подготавливают к электронной микроскопии.

Гибель клеток определяют подсчетом групп ресничек посредством сканирующей микроскопии. Качественные данные получают проведением наблюдений поверхности кортиевых органов при высоком увеличении.

После травмы посредством 120 дБ в течение 30 минут разрушены как внутренние волосковые сенсорные клетки, так и некоторые из трех рядов внешних волосковых сенсорных клеток. Гистология этих клеток позволяет выявлять эффективность соединения (1). Этот продукт делает возможным защиту 100% внутренних волосковых сенсорных клеток и значительной части внешних волосковых сенсорных клеток в случае его перфузии при 100 мкМ за 2 суток перед этой травмой (фиг.4: данные гистологии; фотография A: акустическая травма; фотография B: соединение (1)+акустическая травма; I=внутренние волосковые сенсорные клетки; O=внешние волосковые сенсорные клетки).

Вовлечение активации кальпаина после акустической травмы. Ингибирование соединением 1.

Активацию фермента кальпаина определяют количественной оценкой деградации специфического субстрата фермента, фодрина, до фрагмента 150 кДа.

В клетках улитки в контрольных образцах это расщепление фодрина никогда не выявляют.

Иммунологическое мечение фрагмента 150 кДа, возникающего в результате расщепления фодрина вследствие активации фермента кальпаина, после акустической травмы заметно во внешних клетках улитки, где оно обусловлено мечением посредством антитела к FBDP (“продукты разрушения фодрина”, зеленая флуоресценция; фиг.5A: 48 часов после акустической травмы). Эта активация активности кальпаина после акустической травмы связана с гибелью клеток улитки, выявляемой вследствие отсутствия мечения антителом к кальбиндину, которое позволяет выявлять неповрежденные волосковые сенсорные клетки.

Местное применение 100 мкМ соединения (1), антиоксиданта, ингибирующего активность кальпаина, предотвращает расщепление фодрина ферментом кальпаином в подвергаемых акустической травме клетках улитки. Это отсутствие мечения посредством зеленой флуоресценции, а соответственно отсутствие деградации специфического субстрата кальпаина связано с защитой клеток улитки (меченных антителами к кальбиндину; фиг.5B).

Молекулярные механизмы гибели волосковых сенсорных клеток после акустической травмы. Защита посредством соединения 1.

Для определения природы гибели клеток улитки, обусловленной акустической травмой, проводят фрагментацию ДНК (количественно определяемую способом TUNEL) у подвергшихся акустической травме животных. По этому параметру тестируют эффект соединения 1 для определения его вовлечения в этот механизм клеточной гибели через апоптоз.

В улитках, полученных от контрольных животных, которых не подвергают воздействию шума, TUNEL-позитивных клеток не наблюдают.

Подвергаемая акустической травме улитка имеет в области кортиева органа TUNEL-позитивные клеточные ядра (фиг.6A: 48 часов после акустической травмы). Меченые ядра расположены в верхней области кортиева органа. Поэтому вероятно, что эти меченые ядра принадлежат волосковым сенсорным клеткам, а не поддерживающим клеткам. Многие меченые ядра заметны через один час после акустической травмы, и это мечение остается заметным в течение 4 суток после акустической травмы. Таким образом, клеточная гибель волосковых сенсорных клеток после акустической травмы достигается через механизм апоптоза, связанный с фрагментацией ДНК.

Местное применение 100 мкМ соединения (1), ингибитора активации кальпаина и антиоксиданта, предотвращает мечение ядер волосковых сенсорных клеток (способ TUNEL, фиг.6B: соединение (1) – 48 часов после акустической травмы). Соединение (1) подавляет вызываемую акустической травмой гибель клеток в результате апоптоза.

Утрата целостности волосковых сенсорных клеток после акустической травмы. Защита посредством соединения (1).

Для определения утраты целостности волосковых сенсорных клеток после акустической травмы проводят анализ диффузии цитохрома C посредством иммуноцитохимии с использованием антитела к цитохрому C у животных, которых подвергали акустической травме.

Для определения действия соединения (1) на утрату целостности волосковых сенсорных клеток после акустической травмы его тестируют на высвобождение цитохрома C из митохондриального пространства в цитоплазматическое пространство.

В улитках, получаемых от контрольных животных, которых не подвергают воздействию шума, цитохром C расположен в митохондриях.

В подвергаемых акустической травме улитках наблюдают мечение цитохрома C, рассеянного и распределенного по цитоплазме (фиг.7A).

Местное применение 100 мкМ соединения (1), ингибитора активации кальпаина и антиоксиданта, предотвращает рассеивание цитохрома C из митохондрий в направлении цитоплазмы волосковых сенсорных клеток, подвергаемых акустической травме, и тем самым поддерживает целостность клеток (фиг.7B).

Кривая эффекта дозы соединения (1)

Защитный эффект соединения (1) оценивали посредством изменения величины дозы для определения эффективной дозы, позволяющей восстановить 50% утраченного слуха (ED₅₀). Использовали восемь групп по 5 животных, в том числе животных, получающих только искусственную перилимфу, и животных, получающих 1, 3, 10, 33, 100 мкМ соединения (1), т.е. 30 животных.

Считывание аудиограмм через пять суток после травмы посредством 120 дБ в течение 30 минут позволяет определить эффективную дозу соединения (1) (ED₅₀=3,61 мкМ), которая позволяет восстанавливать 50% утраченного слуха после травмы (фиг.8).

Фаза 2: проявление защитного эффекта соединения (1), вводимого внеулитковой перфузией в последующем лечении, в отношении гибели клеток на протяжении спирали улитки и потери слуха. Определение времени, после травмы, в течение которого соединение (1) позволяет восстанавливать 50% слуха.

Последующее введение соединения (1):

В предварительных исследованиях было показано, что выполняемая после воздействия кохлеостомия усиливает травматические эффекты звука. Таким образом, животные, подвергаемые имплантации после травмы, восстанавливаются не так хорошо, как не подвергаемые имплантации животные. Для устранения связанного с кохлеостомией травматизма авторы разработали нетравматичный способ, осуществляемый введением соединения непосредственно в круглое окно (экстракохлеарно).

Осмотическую помпу имплантируют под кожу, и она доставляет соединение (1) в улитку через катетер (внеулитковая экстракохлеарная перфузия) через 30 минут или 1, 3, 6, 12 или 24 часа после подвергания животных звуковой травме.

Этот эксперимент выполняют на 30 животных.

Соединение (1) вводят в среднее ухо (внеулитковая перфузия) посредством осмотической помпы (объемная скорость потока 1 мкл/час, объем 200 мкл, продолжительность диффузии 7 суток) за 48 часов до или через 1, 3, 6, 12 или 24 часа после травмы. Эту минипомпу имплантируют на постоянной основе в среднее ухо, и она осуществляет диффузию продукта непосредственно в круглое окно.

Эти эксперименты позволяют определить терапевтическое окно для соединения (1) (DH), т.е. максимальное время после травмы, через которое можно вводить соединение (1), проявляющее при этом защитный эффект. Также определяют эффективное время, позволяющее восстанавливать 50% утраченного слуха после травмы (ET₅₀). Кроме того, данный способ позволяет определять через один месяц после акустической травмы защитный эффект соединения (1) в дозе 300 мкМ, в отношении вызываемой травмой гибели клеток на протяжении спирали улитки.

Результаты фазы 2

Соединение (1) в концентрации 300 мкМ.

Функциональный тест: аудиограмма.

Через один час после травмы соединение (1) сохраняет 90% слуха. Время после травмы, через которое можно вводить соединение (1) при сохранении 50% слуха, определяют как составляющее от 6 до 7 часов. Терапевтическое окно для соединения (1) составляет 24 часа после акустической травмы посредством 120 дБ в течение 30 минут. Это означает, что в этой модели соединение (1) активно в течение первых 24 часов после акустической травмы (сравнить с фиг.9: аудиограммы, выполненные через 10 суток после звуковой травмы).

Морфологическое исследование: гистология клеток на протяжении спирали улитки через один месяц после акустической травмы.

Внеулитковая перфузия 300 мкМ соединения (1), которую начинают через шесть часов после акустической травмы, продолжает защищать значительную часть волосковых сенсорных клеток через один месяц после акустической травмы. В действительности, в поврежденной акустической травмой области отсутствуют только 32% внутренних волосковых сенсорных клеток и 18% внешних волосковых сенсорных клеток в сравнении с подвергаемой воздействию шума, но не обрабатываемой соединением (1) противоположной стороной, где в поврежденной акустической травмой области отсутствуют 86% внутренних волосковых сенсорных клеток и 62% внешних волосковых сенсорных клеток.

Формула изобретения

1. Применение гетероциклического производного, соответствующего формуле

в форме диастереоизомеров или любых сочетаний этих форм,
где R представляет собой атом водорода или радикал -C(O)R’,
где R’ представляет собой алкильный радикал,
для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения потери слуха.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что R представляет собой -С(O)-СН₃.

3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что соединение (I) имеет формулу

4. Применение по п.3, отличающееся тем, что соединение (I) имеет формулу

5. Применение по п.3, отличающееся тем, что соединение (I) имеет формулу

6. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что соединение (I) имеет формулу

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что соединение (I) имеет формулу

8. Применение по п.6, отличающееся тем, что соединение (I) имеет формулу

9. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что лекарственное средство вводят в качестве предварительного лечения.

10. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что лекарственное средство вводят в качестве последующего лечения.

11. Применение по п.1 или 2 для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения потери слуха вследствие введения лекарственного средства.

12. Применение по п.11, где лекарственное средство вводят после введения другого лекарственного средства, выбранного из антибиотиков, противоопухолевых лекарственных средств, нестероидных противовоспалительных средств, диуретиков, противоязвенных средств, противосудорожных средств.

13. Применение по п.12, где лекарственное средство вводят после введения антибиотика.

14. Применение по п.13, отличающееся тем, что антибиотик представляет собой гентамицин.

15. Применение по п.1 или 2 для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения потери слуха вследствие пресбиакузиса.

16. Применение по п.1 или 2 для получения лекарственного средства, предназначенного для профилактики и/или лечения потери слуха вследствие акустической травмы.

17. Применение по п.16, отличающееся тем, что лекарственное средство вводят в течение 7 ч, а предпочтительно в течение часа после акустической травмы.

18. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что лекарственное средство сочетают по меньшей мере с одним другим веществом с фармацевтической активностью.

19. Применение по п.18, отличающееся тем, что лекарственное средство сочетают по меньшей мере с одним другим веществом с фармацевтической активностью, эффективным для профилактики и/или лечения потери слуха или для профилактики и/или лечения любых патологий, связанных с потерей слуха.

20. Применение по п.18, отличающееся тем, что другое вещество с фармацевтической активностью выбирают из: антиоксидантов, ингибиторов кальпаина, периферических сосудорасширяющих средств, агонистов или антагонистов рецептора NMDA и пептидных ингибиторов N-концевой киназы c-Jun.
Приоритет по пунктам:

29.03.2004 по пп.3, 4, 5;

14.06.2004 по пп.1, 2, 6-20.

РИСУНКИ

PD4A – Изменение наименования обладателя патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:

ИПСЕН ФАРМА С.А.С. (FR)

Адрес для переписки:

129090, Москва, ул. Б. Спасская, 25, стр. 3, ООО “Юридическая фирма Городисский и Партнеры”

Извещение опубликовано: 27.04.2010 БИ: 12/2010