Патент на изобретение №2377309

(54) МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-ГИДРОКСИАНДРОСТЕНОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к биотехнологии. Способ селективного получения 7-гидроксиандростенов с помощью грибного мицелия, включает трансформацию ⁵ -андростенов с помощью отделенного и отмытого от среды мицелия Curvularia lunata ВКПМ F-981. Причем субстрат используют в виде микрокристаллов, либо в виде комплекса с циклодекстринами. Изобретение позволяет получить выход целевых 7-гидроксипродуктов – 60-90%. 1 з.п. ф-лы.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение касается методов получения лекарственных препаратов стероидной природы с помощью микроорганизмов, конкретнее способа получения 7-гидроксипроизводных стероидов ряда андростана, в частности андростенолона (дегидроэпиандростерона – ДЭА) и его 17-гидроксианалога.

Из литературных источников известно, что 7-гидроксипроизводные стероидных 5-олефинов обладают уникальными биологическими свойствами. У них установлено наличие противоопухолевой, иммуностимулирующей, антихолестеринемической, ноотропной, и радиопротекторной активностей [1-9].

Разносторонняя и высокая биологическая активность ⁵-7-гидроксистероидов делает проблему их синтеза чрезвычайно актуальной и объясняет огромный интерес исследователей к реакции С7-гидроксилирования. Тем не менее, в настоящее время отсутствует перспективный способ получения 7-гидроксипроизводных стероидных 5-олефинов, необходимый для создания целого ряда новых лекарственных препаратов.

Описаны лишь химические способы синтеза такого рода соединений, поскольку аллильное окисление относится к фундаментальным реакциям органической химии [10-14]. Однако наличие таких недостатков, как невысокие выходы, связанные со сложностью проведения процесса окисления и выделения продуктов реакции, а также применение дорогостоящих или вредных для здоровья и экологии веществ, обуславливают неэффективность данных методов получения 7-гидроксистероидов.

Наиболее широко для осуществления реакции 7-гидроксилирования используются соединения шестивалентного хрома в виде комплекса хромового ангидрида с пиридином, хлорхромата и бихромата пиридиния, бихроматов калия или натрия в уксусной кислоте [10, 12]. В числе других реагентов применяются соединения марганца (двуокись и перманганат калия), окислы рутения и селена [13].

Альтернативой химическому синтезу стероидных ⁵-7-гидрокси-олефинов является микробиологическое гидроксилирование, отличающееся стерео- и региоспецифичностью, недоступной химическим методам.

Способность к С7-гидроксилированию стероидной молекулы обнаружена у некоторых представителей высших и низших грибов. Известны примеры применения для С7-гидроксилирования стероидов аскомицетов (Diapothe и Gibberella), дейтеромицетов (представителей родов Cephalosporium, Diplodia, Fusarium) и зигомицетов (Absidia, Cunningamella, Mucor, Rhizopus) [1-5, 15-21]. Однако с участием указанных микроорганизмов описаны трансформации лишь ⁴-3-кетостероидов. Причем продуктами этих реакций, как правило, являются дигидроксипроизводные, а целевые 7-моногидроксисоединения образуются в незначительных количествах.

Наиболее близким к заявляемому способу аналогом является трансформация ДЭА и прегненолона культурой гриба Fusarium moniliforme [5] с образованием соответствующих 7-моногидроксипроизводных – 86% 7-гидрокси-ДЭА (ГДЭА) и 65% 7-гидроксипрегненолона. Для получения указанных 7-гидроксисоединений мицелий Fusarium moniliforme [5] в течение 18 ч предварительно подвергают контакту с ДЭА с целью активации 7-гидроксилазы. Затем биомассу гриба в количестве 10 г/л переносят в свежую питательную среду и проводят трансформацию ДЭА или прегненолона при нагрузке 0,4 г/л в течение 24 ч в аэробных условиях при температуре 27°С. Низкое содержание в среде трансформируемых с помощью Fusarium moniliforme субстратов, необходимость активации 7-гидроксилазы и невысокая скорость гидроксилирования являются основными недостатками указанного способа получения ГДЭА.

Низкая концентрация стероидных соединений в реакционной среде, связанная с их очень низкой растворимостью в водных средах, является особенностью процессов, выполняемых с помощью живых микроорганизмов. Этот фактор наряду с недостаточной доступностью стероидов для микробной клетки, служат, как правило, причиной низкой степени превращения стероидных субстратов и представляют серьезное препятствие для получения стероидных лекарственных препаратов, особенно в промышленном масштабе. Для увеличения нагрузки стероидных субстратов, повышения их биодоступности и степени превращения применяют предварительное механическое измельчение стероида до микрокристаллического состояния, либо вносят в виде мелкодисперсной эмульсии в органических растворителях, иногда проводят реакцию в присутствии растворителя, смешивающегося с водой [20]. Однако органические растворители оказывают токсическое действие на микроорганизмы. Известны также способы внесения стероидных субстратов в виде комплексов с -циклодекстрином (ЦД) [22] или химически модифицированным ЦД (ХМЦД), значительно повышающими растворимость стероидных субстратов и скорость реакций. Однако эффективность ХМЦД продемонстрирована лишь в процессах, осуществляемых с помощью бактерий [23]. Для трансформаций стероидов с помощью грибов ХМЦД ранее не применялись.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в разработке способа селективного 7-гидроксилирования стероидных -5-олефинов андростанового ряда.

Технический результат, который может быть достигнут при осуществлении изобретения, заключается в повышении селективности процесса, увеличении нагрузки стероидного субстрата и повышении его биодоступности.

Сущность способа заключается в использовании для микробиологического процесса гидроксилирования ⁵-андростенов плесневого гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981, а самого субстрата в мелкокристаллическом виде или в виде комплекса включения с ХМЦД.

Примеры использования плесневого гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981 для гидроксилирования стероидов показывают, что ХМЦД существенно увеличивают биодоступность субстрата, о чем свидетельствует высокая скорость модификации стероидной молекулы.

В отличие от растущей культуры гриба Fusarium moniliforme, мицелий Curvularia lunata ВКПМ F-981 проводит селективное 7-гидроксилирование стероидов в отсутствие компонентов питательной среды. Накопление 7-гидроксипродуктов осуществляется мицелием в буферном растворе, содержащим до 10 г/л стероидного субстрата. Для трансформации применяют стероиды или в мелкокристаллическом виде или в виде комплексов с ХМЦД. При этом гидроксилирование 5-андростенов протекает с высокой скоростью – не более 2 суток, и для осуществления 7-гидроксилирования не требуется стадия предварительной активации фермента. Конверсия стероидов грибом Curvularia lunata не сопровождается деструкцией субстрата и продукта, что иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Получение 3,7,17-тригидроксиандрост-5-ена из 3,17-дигидроксиандрост-5-ена.

Споры Curvularia lunata ВКПМ F-981 переносили со скошенной агаризованной среды следующего состава, г/л: дрожжевой экстракт – 4,0, солодовый экстракт – 10,0, глюкоза – 4,0, агар – 25; рН 6,2-6,9, в жидкую среду, содержащую в г/л: сахарозу – 30, дрожжевой автолизат – 2,5, NaNO₃ – 2,0, К₂НРО₄ – 1,0, (NH₄)H₂PO₄ – 3,0, КСl – 0,5, MgSO₄×7H₂O – 0.5, рН 6,0-6,2. Культуру гриба выращивали 72 ч в 100 мл указанной среды в конических качалочных колбах объемом 750 мл при 28°С и скорости перемешивания 220 об/мин. Инокулят переносили в такую же среду и инкубировали в тех же условиях 24 часа. Затем мицелий отделяли от среды и суспендировали в фосфатном буфере, рН 6,0-6,3, содержащем микронизированный 3,17-дигидроксиандрост-5-ен в количестве 2 г/л. Инкубировали на качалке при указанных выше условиях в течение 20-24 ч до исчезновения исходного субстрата.

Мицелий отделяли от буфера, после чего водную фазу трижды экстрагировали хлороформом. Экстракт упаривали, сушили при 60°С и получали кристаллический 3,7,17-тригидроксиандрост-5-ен с выходом 58-62%. Технический продукт промывали ацетоном, сушили при 60°С, кристаллизовали из метанола и получали триол с т.пл. 252-256°С. Спектр ПМР (, м.д.), (D-ДМСО): 0,63 с (18 Me); 0,87 с (19 Me); 3,27 м (3Н); 3,42 м (17Н); 3,57 т (7); 4,03 д (7-ОН) ³J_7-OH,7Hв=6,66 Гц; 4,38 д (17-ОН) ³J_17-OH,17-H=4,78 Гц; 5,40 дд (6Н) J_6,7=5,37 Гц.

Пример 2. Получение 3,7,17-тригидроксиандрост-5-ена из 3,17-дигидроксиандрост-5-ена в присутствии метил--циклодекстрина.

Трансформацию 3,17-диола проводили аналогично примеру 1, но конвертируемый субстрат вносили при нагрузке 5 г/л в фосфатный буфер, содержащий метил--циклодекстрин в соотношении к стероиду 1:1 (моль/моль). Инкубацию осуществляли в течение 48 ч. Получали указанный триол с выходом 70-75%.

Пример 3. Получение 7-гидрокси-ДЭА из ацетата ДЭА. Трансформацию ацетата ДЭА проводили аналогично примеру 2, но для гидроксилирования использовали ацетат ДЭА при нагрузке 10 г/л, который инкубировали в течение 44-48 ч. Полученную после отделения мицелия водную фазу экстрагировали этилацетатом, экстракт упаривали и получали с количественным выходом 7а-гидрокси-ДЭА в виде очень густого (вязкого) масла. После обработки масла водным ацетоном получали кристаллический продукт с т.пл. 181-184°С. Лит.данные 181,5-183,5°С [15]. Масс-спектр (m/z): 304 (М⁺), 286, 271, 253. Спектр ¹ПMP (СDСl₃) (, м.д.): 0,86 с (18 Me)); 0,99 с (19 Me); 3,55 м (³J_3,2=11,1, 3Н); 3.94 м (³J_6,7=5,3 гц, 7Н); 5,61 кв (6H).

Пример 4. Получение 7-гидрокси-ДЭА из ДЭА.

Гидроксилирование ДЭА при нагрузке 4 г/л проводили алогично примеру 2. Трансформация ДЭА заканчивалась через 19 ч с выходом 7а-гидрокси-ДЭА 85%.

Пример 5. Получение 7-гидрокси-ДЭА из ацетата ДЭА в присутствии ЦД и гидроксипропил-ЦД.

Гидроксилирование ацетата ДЭА осуществляли аналогично примеру 3, но вместо метил-в-циклодекстрина в качестве солюбилизатора использовали в-циклодекстрин, либо гидроксипропил-ЦД. Трансформацию ацетата ДЭА проводили 48 ч. После обработки аналогично примеру 3 получали 60-76% 7-гидрокси-ДЭА, идентичного полученному в примере 3.

Литература

6. Sebastien W-E., David J-P., Sasdovitch V., Liere P., Schumacher M.

940017640. 1996.

Формула изобретения

1. Микробиологический способ получения 7-гидроксиандростенов с помощью грибного мицелия, отличающийся тем, что трансформацию ⁵-андростенов проводят с помощью отделенного и отмытого от среды мицелия Curvularia lunata ВКПМ F-981, а субстрат используют в виде микрокристаллов либо в виде комплекса с циклодекстринами.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве циклодекстринов используют -циклодекстрин или его химически модифицированные производные, такие, как метилциклодекстрин и гидроксипропил-циклодекстрин.