Патент на изобретение №2377297

(54) ШТАММ 8С12 ПОСТОЯННОЙ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЫШИ Mus. musculus И ОВЦЫ Ovis aries – ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЛИКОПРОТЕИДНОМУ АНТИГЕНУ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(57) Реферат:

Получен штамм 8С12 межвидовых гибридных клеток мыши Mus musculus и овцы Ovis aries – продуцент моноклональных антител овцы к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС). Штамм депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных под 72. Штамм является постоянной гибридной линией клеток и обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител овцы. Титры антител в нативной культуральной жидкости составляют 1:32-1:64 в иммуноферментном анализе (ИФА). Моноклональные антитела специфичны к общей антигенной детерминанте гликопротеидов вируса лейкоза КРС – наружного gp51 и трансмембранного gp30. При использовании в ИФА для выявления антител в сыворотке крови и молоке инфицированного вирусом лейкоза КРС моноклональные антитела обеспечивают прочное избирательное связывание с твердофазным носителем и оптимальную пространственную ориентацию гликопротеидного антигена. Штамм 8С12 может быть использован при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, что позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий, уменьшить сроки оздоровления неблагополучных по лейкозу животноводческих хозяйств и, как следствие, снизить заболеваемость КРС лейкозом. 1 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению клеточных гибридов, используемых при иммунохимических исследованиях.

Методы гибридизации соматических клеток в настоящее время широко применяются для решения многих проблем биологии, медицины, ветеринарии. Гибридные линии клеток животных используют для решения проблем вирусологии, патологии сельскохозяйственных животных, получения биологически активных веществ и моноклональных антител, которые могут использоваться для приготовления высокоспецифических диагностических реагентов с целью выявления вирусов или антител к ним в биологических жидкостях.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота вызывает злокачественное лимфопролиферативное заболевание крупного рогатого скота – лейкоз, который занимает первое место в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота в Российской Федерации. Инфекционный процесс характеризуется отсутствием виремии с одновременной продукцией антител к белкам вируса, среди которых преобладают антитела к гликопротеиду вирусной оболочки (gp51).

Для диагностики болезни широко применяются серологические методы исследования, а именно – реакция диффузионной преципитации в геле агара (РДП) и иммуноферментный анализ (ИФА). Чувствительность серологических методов высока в тех случаях, когда они направлены на выявление антител к гликопротеиду gp51.

Необходимость данной работы обусловлена тем, что наибольшей чувствительностью и специфичностью при выявлении антител к вирусу лейкоза обладают тест-системы на основе принципа иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител для осуществления фиксации антигена на стадии сенсибилизации твердофазной основы. Такие тест-системы значительно превосходят по чувствительности и специфичности традиционные, в которых сенсибилизация твердой фазы осуществляется при непосредственной адсорбции очищенного вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Известны штаммы гибридомной культуры клеток, продуцирующей антитела к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота. Штаммы клеток, продуцирующих моноклональные антитела к gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота, получали в результате слияния лимфоцитов мышей, иммунизированных поверхностным антигеном вируса лейкоза крупного рогатого скота gp51 с клетками мышиной миеломы. После селекции и клонирования полученных гибридов клетки вводили внутриперитонеально мышам. Асцитическую жидкость использовали как источник моноклональных антител к gp51 вируса лейкоза (1).

Иммунизация мышей вирусом лейкоза крупного рогатого скота недостаточно эффективна, так как мышь не относится к чувствительным к этому вирусу видам животных и отвечает на иммунизацию недостаточно интенсивным образованием клеток, продуцирующих антитела; кроме того, содержание гликопротеидного антигена в препаратах очищенных вирионов очень низкое. Иммунизации мышей очищенным гликопротеидным антигеном более эффективна, однако сама процедура очистки довольно трудоемкая при низком выходе продукта. В свою очередь, сами моноклональные антитела должны обладать рядом свойств, определяющих возможность их использования в диагностической тест-системе твердофазного иммуноферментного анализа. Моноклональные антитела, которые могут быть пользованы для фиксации антигена на твердофазном носителе, должны прочно связывать антиген и обеспечивать доступность его эпитопов для анализируемых антител.

Известен штамм межвидовой гибридомной культуры клеток, продуцирующей антитела к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота ВМАb/сс-1, полученный при слиянии лимфоцитов периферической крови теленка голштинской породы, гипериммунизированного инактивированным антигеном ВЛКРС с клетками мышиной миеломы SP2/0-Agl4. Штамм обладает высокой продукцией моноклональных антител крупного рогатого скота подкласса IgG₁, специфичных к гликопротеидному антигену ВЛКРС в ИФА. При изучении в вестерн-блот-анализе моноклональные антитела выявлена иммунореактивность моноклональных антител против вирусного антигена, который представляет собой гликопротеид с мол. массой 69 Кд. Асцитные антитела, полученные в результате интраперитонеальной инокуляции 1×10⁷ клеток гибридомы мышам BALB/c-nu/nu, в четырехкратном разведении, оказывали 50% ингибирующее действие на ранний поликариоцитоз (2).

В задачу наших исследований входило получить штамм гибридных клеток, обладающих in vitro высокой продукцией моноклональных антител к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота, обладающих высокой авидностью и аффинностью и обеспечивающих оптимальную пространственную ориентацию антигена, фиксированного с помощью этих антител на твердофазном носителе, при использовании в диагностической тест-системе.

Получен межвидовой гибридный штамм клеток миеломы мыши Р3-X63-Ag-8. 653 со спленоцитами овцы, инфицированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Штамм межвидовых гибридных клеток 8С12 является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодным для биотехнологии при наработке препаратов.

С целью инфицирования вирусом лейкоза крупного рогатого скота овце подкожно ввели 2 мл культуральной жидкости культуры клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированной вирусом лейкоза крупного скота. Через 2 недели после инокуляции вируссодержащего материала в крови овцы методом РДП были выявлены антитела к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС. Через 1 месяц ввели внутривенно препарат, антигена ВЖРС, полученный осаждением с помощью полиэтиленгликоля (7%) из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры.

На 3 сутки после бустерного введения овцу убивали, извлекали селезенку и проводили слияние клеток селезенки инфицированной ВЛКРС овцы с клетками мышиной миеломы линии P3-X63-Ag-8. 653.

Слияние клеток проводили по стандартной методике с использованием ПЭГ с м.м. 1500. Соотношение клеток миеломы и лимфоцитов составляло 1:4-1:10. Селекцию гибридом проводили на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридомы культивировали на 96-луночных панелях производства фирмы «Nunc» на среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров в атмосфере, содержащей 5% СO₂.

Скрининг гибридом на продукцию специфических моноклональных антител проводили методом непрямого твердофазного ИФА с использованием препарата очищенного ВЛКРС в концентрации 5 мкг/мл для сенсибилизации твердой фазы и видоспецифического иммунопероксидазного конъюгата – для выявления связавшихся антител. Клонирование и реклонирование клеточных культур проводили на 96-луночных панелях методом предельных разведений с использованием макрофагального фидерного слоя.

В результате был отобран и размножен клон клеток, продуцирующий моноклональные антитела к гликопротеиду вируса лейкоза крупного рогатого скота. Этот клон клеток был последовательно размножен в 96-, 24-луночных панелях, а затем в культуральных матрасах.

Была определена видовая принадлежность и специфичность моноклональных антител, продуцируемых отобранным клоном методами ИФА, иммуноблоттинга и иммуноцитохимии и дана количественная оценка продукции антител.

Штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки: Клетки однородные, округлой формы с крупным овальным ядром, содержащим от 1 до 3, чаще 1-2 ядрышек. При посеве клетки равномерно распределяются на поверхности субстрата и в культуральной жидкости. Индекс пролиферации составляет 5-6.

Культуральные свойства. Межвидовой гибридный штамм 8С12 культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Клетки размножаются в суспензии и частично – прикрепляясь к поверхности культурального сосуда. Посевная концентрация 1×10⁴ клеток на 1 мл среды. Через 5-7 суток с момента посева 80% культуральной жидкости удаляют вместе с находящимися в ней клетками. К оставшимся клеткам добавляют такой же объем свежей питательной среды. рН среды 7,2-7,4. Периодичность субкультивирования – 1 раз в 3-5 суток. Кратность рассева 1:5.

Иммунологические свойства. Моноклональные антитела распознают общую антигенную детерминанту наружного гликопротеида gp51 и трансмембранного гликопротеида gp 30 вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Контаминация. Контаминация простейшими, грибами, бактериями, микоплазмами, вирусами не выявлена.

Хранение культур. Среда для замораживания: 70% среды RPMI-1640, 20% сыворотки эмбрионов коров, 10% диметилсульфоксида. Концентрация клеток в пластиковых криопробирках 1,5Ч10⁶ кл/мл. Режим замораживания: до -70°С – -1°/мин, далее – жидкий азот (-196°С) Восстановление после замораживания: быстрое размораживание при 37°С, центрифугирование при 1200 об/мин 10 мин, ресуспендирование в ростовой среде. Жизнеспособность после размораживания 70-80%.

Предложенный штамм гибридных клеток мыши Mus. Musculus 8С12, продуцент моноклональных антител овцы к оболочечному гликопротеиду gp51 ВЛКРС хранится в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под 72.

Штамм используют при изготовлении диагностической тест-системы для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.

Пример 1. Культивирование штамма in vitro и количественная оценка продукции антител. Клетки штамма 8С12 культивируют в стеклянных матрасах при температуре 37,0°С в питательной среде, состоящей из среды RPMI-1640 и 10% сыворотки крови эмбрионов крови антибиотиков (пенициллина и стрептомицина по 500000 ед/л). Оптимальная плотность посадки 2×10⁴ клеток/мл среды. Через 3-5 суток после образования суспензии культуральную жидкость частично удаляют и добавляют необходимое количество свежей питательной среды. Титр антител к гликопротеидному антигену ВЛКРС в культуральной жидкости определяют методом иммуноферментного анализа с очищенным антигеном ВЛКРС и видоспецифическими антителами кролика против глобулинов овцы, меченными пероксидазой. В нативной (неконцентрированной) культуральной жидкости он составляет 1:32.

Пример 2. Иммунологические свойства моноклональных антител. Очищенный вирус лейкоза крупного рогатого скота разделяли методом электорофореза в 12,5% геле СДС-ПААГ (додецил-сульфат натрия-полиакриламид) и после переноса на нитроцеллюлозный фильтр проводили инкубацию с моноклональными антителами, продуцируемыми культурой 8С12 и затем, после промывания фильтра – с меченными пероксидазой антителами против глобулинов овцы. Связавшуюся пероксидазу проявляли раствором, содержащем 3,3′-диаминобензидинтетрагидрохлорида в 0,1 М трис-НС1, рН 7,4 и 1:5000 перекиси водорода Н₂O₂. Проявлялись две окрашенные полосы в двух зонах, соответствующих по молекулярной массе наружному гликопротеиду gp51 и трансмембранному гликопротеиду gp 30 вируса лейкоза крупного рогатого (с молекулярной массой 67 и 31 КДа).

Пример 3. Иммунологические свойства моноклональных антител. Из культуральной жидкости культуры 8С12, полученной, как описано в примере 1, выделяли иммуноглобулины трехкратным осаждением раствором сульфата аммония 50% от насыщения с последующим диализом. Иммуноглобулины метили пероксидазой периодатным методом (3). Первичную культуру куриных фибробластов заражали рекомбинантным штаммом вируса осповакцины WR 601 BLV со встроенным в ДНК геном env вируса лейкоза крупного рогатого скота. Рекомбинантный вирус характеризуется высокой экспрессией полного продукта гена env ВЛКРС (gp51+gp30). Множественность заражения составляла 2-3 БОЕ на 1 клетку. Через 48 часов культивирования при 37°С удаляли культуральную жидкость, монослой фиксировали раствором Буэна и инкубировали с моноклональными антителами, продуцируемыми культурой 8С12, меченными пероксидазой. Реакцию проявляли окрашиванием ДАБ-Н₂О₂. Фокусы ЦПД окрашивались в коричневый цвет.

Пример 4. Проведение иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител. Моноклональные антитела овцы к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота, продуцируемые штаммом 8С12, были использованы для фиксации антигена ВЛКРС на твердой фазе в непрямом иммуноферментном анализе. Для иммобилизации антигена применяли трехстадийный метод фиксации. На первой стадии поверхность пластика панели для микротитрования сенсибилизировали за счет неспецифической адсорбции препаратом моноклональных антител 1Н8 к иммуноглобулинам овцы, продуцируемых штаммом 1Н8 (депонирован в СХЖ РАСХН под 73) из раствора с концентрацией 5 мкг/мл при рН 7,2-2-7,4. Инкубацию проводили в течение 16-20 часов при 4°С. На второй стадии проводили иммобилизацию за счет специфического иммунологического взаимодействия моноклональных антител к гликопротеидному антигену gp51 ВЛКРС из культуральной жидкости штамма 8С12 (депонирован в СХЖ РАСХН под 72) в течение 1,5 часов при 37°С. На третьей стадии проводили иммобилизацию также за счет специфического иммунологического взаимодействия антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры. Избыток реагентов после каждой стадии сенсибилизации твердой фазы и проведения иммуноферментного анализа отмывали раствором детергента на фосфатно-солевом буферном растворе. Вносили контрольные и анализируемые образцы сыворотки крови крупного рогатого скота и инкубировали в течение 1,5 часов при 37°С. В качестве детектирующих антител использовали меченные пероксидазой моноклональные антитела против глобулинов крупного рогатого скота, не дающие перекрестных реакций с иммуноглобулинами овцы, продуцируемые штаммом 5А10 (депонирован в СХЖ РАСХН под 71).Инкубацию проводили в течение 1,5 часов при температуре 37°С. Учет реакции проводили по изменению оптической плотности анализируемых образцов по сравнению с контрольными образцами после добавления субстратной смеси, содержащей тетраметилбензидин (ТМВ) и перекись водорода Н₂O₂. Положительными считали пробы, оптическая плотность которых в два и более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля

При проведении исследования 662 сывороток крови из неблагополучного по лейкозу хозяйства параллельно в реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментном анализе совпадение результатов (РДП+/ИФА+; РДП-/ИФА-) отмечали в 560 или 84,6%, несовпадение (РДП+/ИФА-; РДП-/ИФА+) – в 15,4% случаев. Только 3 положительные по результатам РДП-пробы прореагировали отрицательно в ИФА (0,5%). По чувствительности метод иммуноферментного анализа превосходил РДП с гликопротеидным антигеном и не уступал ей по специфичности. В ИФА было выявлено 190 (28,7%) положительных проб, тогда как в РДП – только 94 (14,2%), т.е. на 14,5% или в два раза больше.

Предложенный штамм апробирован с положительным результатом в лабораторных условиях Всероссийского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и Курской биофабрики с 2006 по 2007 гг.

Технико-экономическое обоснование. Получен штамм 8С12 гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела, характеризующийся следующими полезными свойствами:

– является постоянной линией клеток с неограниченным сроком жизни, пригодным для биотехнологии при наработке препаратов;

– обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител. Титры антител в нативной культуральной жидкости составляли 1:32-1:64 в иммуноферментном анализе;

– моноклональные антитела специфичны к общей антигенной детерминанте гликопротеидов вируса лейкоза – наружного gp 51 и трансмембранного gp30.

– Моноклональные антитела обеспечивают прочное связывание гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота с твердофазным носителем во время проведения иммуноферментного анализа.

– Пространственное расположение гликопротеидного антигена, связанного с твердофазным носителем посредством моноклональных антител при проведении иммуноферментного анализа, обеспечивает выявление антител в сыворотке крови естественно инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота с высокой чувствительностью и специфичностью.

Штамм 8С12 – продуцент моноклональных антител к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота – найдет применение при изготовлении иммуноферментной тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Использование этой тест-системы позволит повысить эффективность оздоровительных мероприятий, уменьшить сроки оздоровления неблагополучных по лейкозу животноводческих хозяйств и в итоге – резко снизить заболеваемость крупного рогатого скота лейкозом.

Источники информации

1. Журнал. Virology. – 1982, – v.l22, – p.342-352.

2. Журнал. Jpn.J.Vet.Sci. – 1988, – v.50, – р.1136-1138.

3. Книга “Immunofluorescence and related staining techniques” под ред. W Knapp. – Elsevier: North-Holland Biomedical Press. – 1978. – 215-221.

Формула изобретения

Штамм 8С12 постоянной межвидовой гибридной линии клеток мыши Mus. musculus и овцы Ovis aries – продуцент моноклональных антител овцы к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота, депонирован в «Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН)» г.Москвы под 72.