Патент на изобретение №2377295
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
(57) Реферат:
Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих включает сбалансированный солевой раствор, источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов в виде растительного гидролизата, аминокислоты и витамины. В качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,2-2,8 мас.%, остаточного азота 3,0-4,2 мас.% и/или соевой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,9-3,5 мас.%, остаточного азота 5,6-6,6 мас.% при следующем содержании компонентов: ферментативный гидролизат рисовой и/или соевой муки 3-20 г/л, аминокислоты 0,11-0,86 г/л, витамины 0,55-22,5 мг/л, сбалансированный солевой раствор до 1 л. Это обеспечивает стандартизованность и удешевление питательной среды специально для культивирования клеток MDCK и Vero, используемых в производстве культуральных противогриппозных вакцин. 3 з.п. ф-лы, 3 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к питательным средам, пригодным для роста и пролиферации клеток млекопитающих и для репродукции в них вирусов, например вируса гриппа. Питательные среды для культур клеток предназначены для поддержания необходимых для их роста физико-химических условий и обеспечения клеток питательными веществами, необходимыми для наработки клеточной биомассы. Развитие биотехнологии, и ее выход на промышленный уровень привело к увеличению потребности и расширению ассортимента питательных сред для культур клеток. Конструирование питательных сред на основе гидролизатов растений позволяет существенно уменьшить риск контаминации препаратов животными патогенами, а также заметно снизить стоимость среды. Однако в связи с тем, что указанная среда изготавливается во Франции и импортируется в Российскую Федерацию, в условиях биотехнологического производства, где требуется большое количество питательной среды для получения клеточной биомассы, использование среды нерентабельно. При применении данной среды резко возрастает стоимость вирусных вакцин и других препаратов, сырьем для которых она является. Известна питательная среда на основе среды Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки и трипсина в количестве (0,05-1,0 мкг/мл) для культивирования аттестованных перевиваемых линий клеток (Vero, MDCK) для наработки высокопродуктивных штаммов вируса гриппа (патент США Однако использование для культивирования клеток питательной среды Игла MEM с добавлением 5-10% фетальной сыворотки приводит к внесению в конечный продукт (вакцину) компонентов сырья животного происхождения, которые могут являться источником посторонних вирусов, микоплазм, прионов, а также вызывать дополнительную аллергизацию иммунизируемого организма. Наиболее близким аналогом (прототипом) является питательная среда для культивирования клеток млекопитающих, включающая сбалансированную синтетическую среду DMEM/F12, 199 или RPMI, источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов в виде растительного гидролизата, аминокислоты и витамины (патент РФ Однако данная питательная среда предназначена для культивирования клеток животных СНО и ВНК. Данных по культивированию животных клеток MDCK и Vero в описании к патенту не имеются. Растительные гидролизаты в жидкой форме получены путем температурного на них воздействия с получением бульона. Данная технология не позволяет обеспечить глубокое расщепление субстрата, что обуславливает низкий выход аминокислот и витаминов. Техническим результатом изобретения является создание более стандартизованной и дешевой питательной среды специально для культивирования клеток MDCK и Vero, используемых в производстве культуральных противогриппозных вакцин. Указанный технический результат достигается тем, что в питательной среде для культивирования клеток млекопитающих, включающей сбалансированный солевой раствор, источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов в виде растительного гидролизата, аминокислоты и витамины согласно изобретения в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой и/или соевой муки при следующем содержании компонентов:
В качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Хенкса, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат соевой муки, в качестве аминокислот она содержит L-глутамин, L-цистин и в качестве витаминов – холин хлорид, фолиевая кислота, никотинамид, кальция пантотенат, пиридоксаль гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, мио-инозитол и рибофлавин при следующем содержании компонентов:
В качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Эрла, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой муки, в качестве аминокислот: L-глутамин, L-цистин, L-аргинин, триптофан и в качестве витаминов: Д-биотин, холин-хлорид, фолиевая кислота, никотинамид, никотиновая кислота, кальция пантотенат, пиридоксин гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, рибофлавин, мио-инозитол, витамин B12 при следующем содержании компонентов:
В качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Эрла, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой муки и ферментативный гидролизат соевой муки, в качестве аминокислот – L-глутамин, L-цистин, L-аргинин, триптофан, а в качестве витаминов – D-биотин, холин-хлорид, фолиевая кислота, никотинамид, никотиновая кислота, кальция пантотенат, пиридоксин гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, рибофлавин, мио-инозитол, витамин В12 при следующем содержании компонентов:
Заявляемая питательная среда содержит ферментативный гидролизат растительных белков, который включает компоненты с высокой питательной ценностью, в частности ферментативный гидролизат рисовой и/или соевой муки, в который дополнительно добавляют не более 4 аминокислот и до 11 витаминов, что позволяет снизить цену конечного продукта. Среды обладают высокой ростстимулирующей активностью по отношению к клеточным культурам Vero и MDCK, используемым в производстве культуральных противогриппозных вакцин. Кроме того, настоящее изобретение позволяет снизить содержание сыворотки в питательной среде. Заявляемая среда для культивирования клеток млекопитающих, содержащая ферментативные гидролизаты рисовой и соевой муки, с пониженной концентрацией сыворотки крови КРС, способна поддерживать жизнеспособность и пролиферацию клеток также эффективно, как и среда, содержащая сыворотку. Пример 1. Получение ферментативного гидролизата Указанный результат достигается тем, что ферментативный гидролизат соевой муки и рисовой муки получают при следующих условиях: Соотношение субстрат: вода 1:8. Соотношение фермент: субстрат от 0,05 г до 0,2 г фермента на 1 г субстрата (оптимально 0,15). Температура гидролиза 38-40°С. рН гидролиза от 7,6 до 8,0 ед. рН (оптимально 7,6-7,8 ед. рН). время гидролиза от 5 до 24 ч, (оптимально 15 ч). Получение ферментативного гидролизата. К обезжиренной и промытой подкисленной водой для удаления окрашенных пигментов соевой (рисовой) муке, добавляют очищенную воду и протеолитический фермент, например папаин, устанавливают необходимые для гидролиза температуру и величину рН. Критерием окончания процесса гидролиза служит постоянство величины аминного азота. После окончания процесса гидролиза смесь прогревают для инактивации фермента при температуре не более 100°С в течение 5-10 мин, затем охлаждают и фильтруют через картон для фильтрации биологических жидкостей, а затем микропористые капроновые фильтры. Приготовленный таким образом жидкий раствор гидролизата лиофильно высушивают. Полученный ферментативный гидролизат имеет следующие физико-химические характеристики: Концентрация водородных ионов 1%-ного раствора гидролизата, рН в пределах 6,2-6,7 ед. рН. Растворимость 5 г гидролизата в 100 мл очищенной воды, не более 3 мин. Массовая доля влаги, не более 3%. Массовая доля общего азота, в пределах 3,2-4,6% для гидролизата рисовой муки и для гидролизата соевой муки 5,8-7,6%. Массовая доля аминного азота, в пределах 2,2-2,8% для гидролизата рисовой муки и для гидролизата соевой муки 2,9-3,5%. Массовая доля остаточного азота в пределах 3,0-4,2% для гидролизата рисовой муки и для гидролизата соевой муки 5,6-6,6%. Строгое соблюдение условий гидролиза и регулярный контроль физико-химических параметров в процессе гидролиза позволяет получать в достаточной степени стандартный продукт, имеющий разброс количественных показателей аминокислот не более 20%. Пример 2. Составы питательных сред Подобраны концентрации ферментативных гидролизатов, обеспечивающие оптимальные условия для роста и жизнедеятельности клеточных культур культуры (от 3 до 10 г/л), что соответствует содержанию аминного азота в традиционных средах (Игла MEM -120 мг/л, 199 М – 80 мг/л). Среды для культивирования клеточных культур готовят следующим образом. 1. Питательная среда на основе ферментативного гидролизата соевой муки: в 1 л сбалансированного раствора Хенкса растворяют ферментативный гидролизат в количестве от 3 до 10 г (оптимально 5 г), L-глутамин в количестве 0,1-0,3 г/л среды), L-цистин в количестве 0,01-0,04 г/л среды и следующие 8 витаминов: холин хлорид от 0,2 до 1,0 мг/л среды, фолиевая кислота от 0,2 до 1,0 мг/л, никотинамид от 0,2 до 1,0 мг/л, кальция пантотенат от 0,2 до 1,0 мг/л, пиридоксаль гидрохлорид от 0,2 до 1,0 мг/л, тиамин гидрохлорид от 0,2 до 1,0 мг/л, мио-инозитол от 0,2 до 1,0 мг/л, рибофлавин от 0,02 до 0,1 мг/л. 2. Питательная среда на основе ферментативного гидролизата рисовой муки: в 1 л сбалансированного раствора Эрла растворяют ферментативный гидролизат в количестве от 3 до 10 г (оптимально 5 г), добавляют аминокислоты: L-глутамин в количестве 0,1-0,3 г/л среды, L-цистин в количестве 0,01-0,04 г/л среды, L-аргинин в количестве 0,01-0,5 г/л среды, триптофан в количестве 0,002-0,02 г/л среды, и следующие 11 витаминов: D-биотин от 0,01 до 0,5 мг/л среды, холин-хлорид от 0,2 до 5 мг/л среды, фолиевая кислота от 0,01 до 0,5 мг/л среды, никотинамид от 0,02 до 1,0 мг/л среды, никотиновая кислота от 0,02 до 1,0 мг/л среды, кальция пантотенат от 0,01 до 0,5 мг/л среды, пиридоксин гидрохлорид от 0,02 до 1,0 мг/л среды, тиамин гидрохлорид от 0,01 до 0,5 мг/л среды, рибофлавин от 0,01 до 0,5 мг/л среды, мио-инозитол от 0,04 до 2,0 мг/л среды витамин В12 от 0,2 до 10 мг/л среды. 3. Питательная среда на основе смеси ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки: в 1 л сбалансированного раствора Эрла растворяют ферментативный гидролизат рисовой муки в количестве от 3 до 10 г (оптимально 5 г), ферментативный гидролизат соевой муки в количестве от 1 до 10 г (оптимально 2 г), и добавляют аминокислоты: L-глутамин в количестве 0,1-0,3 г/л среды, L-цистин в количестве 0,01-0,04 г/л среды, L-аргинин в количестве 0,01-0,5 г/л среды, триптофан в количестве 0,002-0,02 г/л среды, и следующие 11 витаминов: D-биотин от 0,01 до 0,5 мг/л среды, холин-хлорид от 0,2 до 5 мг/л среды, фолиевая кислота от 0,01 до 0,5 мг/л среды, никотинамид от 0,02 до 1,0 мг/л среды, никотиновая кислота от 0,02 до 1,0 мг/л среды, кальция пантотенат от 0,01 до 0,5 мг/л среды, пиридоксин гидрохлорид от 0,02 до 1,0 мг/л среды, тиамин гидрохлорид от 0,01 до 0,5 мг/л среды, рибофлавин от 0,01 до 0,5 мг/л среды, мио-инозитол от 0,04 до 2,0 мг/л среды, витамин B12 от 0,2 до 10 мг/л среды. Пример 3. Данные по оценке ростстимулирующих свойств питательной среды (ПС) Проведена оценка ростстимулирующих свойств ПС в процессе пассирования на ней перевиваемых линий клеток Vero и MDCK. В качестве контроля для сравнительного анализа ростовых свойств для клеточной культуры Vero использовали синтетическую среду Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови КРС. Пролиферативная активность клеток Vero, культивируемых на питательных средах представлена в таблице 1.
Клетки Vero, выращенные в экспериментальных средах, имели форму, характерную для данного вида клеток, с четко выраженными границами, без признаков дегенерации и морфологически не отличались от клеток, выращенных в контрольной среде. Пролиферативная активность клеток MDCK, культивируемых на мало сывороточных питательных средах представлена в таблице 2.
Культура клеток MDCK, пассируемая на питательной среде Игла MEM с добавлением 5% сыворотки крови плодов коров (контрольная культура клеток), состоит из эпителиоподобных клеток с крупными ядрами разнообразной формы, содержащими крупные ядрышки от одного до нескольких. Цитоплазма иногда ячеистая с включениями. Культура клеток MDCK формирует монослой на 2-3 сутки роста. Индекс пролиферации культуры после I пассажа составил 4,0. При пассировании клеточной культуры на питательной среде для культивирования клеток MDCK (Axcevir-MDCK) с добавлением 2% сыворотки крови плодов коровы (вторая контрольная клеточная культура) клетки имеют типичную для данной линии морфологию, формируют монослой на 2-3 сутки, сохраняют высокую пролиферативную активность (индекс пролиферации клеточной культуры после I пассажа составил 5,4). При пассировании клеток MDCK на экспериментальной среде на основе ферментативных гидролизатов рисовой муки с добавлением 2% сыворотки крови плодов коровы отмечаются незначительные изменения морфология клеток, клетки несколько удлиненной веретенообразной формы, при этом наложения слоев клеток не наблюдается. Несмотря на незначительные отличия морфологии клеток, пассируемых в экспериментальной среде по сравнению с пассируемыми в контрольных средах ростстимулирующая активность питательной среды на основе гидролизата рисовой муки сопоставима с контролем (индекс пролиферации клеток после I пассажа составлял 4,5). Таким образом, описываемый способ получения ПС на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки позволяет получить среды с высокими росстимулирующими свойствами для некоторых перевиваемых клеточных культур млекопитающих, что позволяет применять ее для получения большого количества клеточной биомассы в биотехнологических производствах. Пример 4. Данные по оценке репродукция холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа H1N1, H3N2 и В Проведена оценка репродукции холодоадаптированных реассортантных вакцинных штаммов вируса гриппа H1N1, H3N2 и В, выращенных на клетках MDCK в различных средах. Изучение размножения реассортантных штаммов, выращенных при использовании экспериментальных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки показало, что все вирусные са+-штаммы хорошо размножаются с максимальным титром 108,5-109,0 ЭИД50/мл при оптимальной множественности заражения 0,001 ЭИД50/кл, что совпадает с максимальными титрами при использовании контрольных сред – Игла MEM и Axcevir-MDCK. Результаты размножения реассортантных штаммов, выращенных при использовании экспериментальных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой муки представлены в таблице 3.
Формула изобретения
1. Питательная среда для культивирования клеток млекопитающих MDCK и Vero, используемых в производстве противогриппозных вакцин млекопитающих, включающая сбалансированный солевой раствор в виде раствора Хенкса или раствора Эрла, источник питательных веществ и ростстимулирующих факторов в виде растительного гидролизата рисовой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,2-2,8 мас.%, остаточного азота 3,0-4,2 мас.%, и/или соевой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,9-3,5 мас.%, остаточного азота 5,6-6,6 мас.%, аминокислоты и витамины при следующем содержании компонентов:
2. Среда по п.1. отличающаяся тем, что в качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Хенкса, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат соевой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,9-3,5 мас.%, остаточного азота 5,6-6,6 мас.%, в качестве аминокислот она содержит L-глутамин, L-цистин и в качестве витаминов – холин хлорид, фолиевую кислоту, никотинамид, кальция пантотенат, пиридоксаль гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, миоинозитол и рибофлавин при следующем содержании компонентов:
3. Среда по п.1, отличающаяся тем, что в качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Эрла, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,2-2,8 мас.%, остаточного азота 3,0-4,2 мас.%, в качестве аминокислот L-глутамин, L-цистин, L-аргинин, триптофан и в качестве витаминов: Д-биотин, холин-хлорид, фолиевую кислоту, никотинамид, никотиновую кислоту, кальция пантотенат, пиридоксин гидрохлорид, тиамин гидрохлорид, рибофлавин, миоинозитол, витамин В 12 при следующем содержании компонентов:
4. Среда по п.1, отличающаяся тем, что в качестве сбалансированного солевого раствора она содержит раствор Эрла, в качестве растительного гидролизата она содержит ферментативный гидролизат рисовой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,2-2,8 мас.%, остаточного азота 3,0-4,2 мас.% и ферментативный гидролизат соевой муки с рН 6,2-6,7, содержанием аминного азота 2,9-3,5 мас.%, остаточного азота 5,6-6,6 мас.%, в качестве аминокислот -:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
6344354, МПК С12N 5.00, C12N 7/00, опубл. 05.02.2002).