Патент на изобретение №2376606

(54) СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины и касается способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека. Сущность изобретения включает внесение в лунки микропанели в качестве активатора классического пути комплемента – дерината, затем реагента R4 и анализированной пробы, инкубацию, удаление содержимого лунок, внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 комплемента, инкубацию, удаление инкубационного раствора, внесение субстрата фермента и проведение расчета активности С4 компонента по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Изобретение также включает набор для определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности способа. 2 н.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Известен способ определения функциональной активности компонента C4, преимущественно его изотипа С4В [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета липополисахарида, затем определяемого C4 из растворов, его содержащих, в присутствии реагента R4, т.е. сыворотки крови человека, лишенной активности C4. Количество ковалентно связавшегося компонента CЗ зависит от концентрации функционально активного определяемого компонента C4. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента СЗ определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к СЗ, конъюгированных с ферментом.

Единственным недостатком этого способа является трудность в сорбции липополисахарида на полистироловых микропанелях, обычно используемых в иммуноферментном анализе, и плохое сохранение активирующей способности при хранении.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С4 классического пути системы комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора классического пути комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего реагент R4 (сыворотки крови человека, лишенной активности компонента С4), и анализируемой пробы, содержащей компонент C4 комплемента человека с неизвестной активностью, и проведение инкубации, в ходе которой происходит формирование C3-конвертазы (C4b2а) на сорбированном активаторе в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С4, в результате чего происходит активация этой конвертазой компонента C3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном активаторе, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента CЗ человека и субстрата этого фермента и проведение расчета активности компонента C3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, реагент R4 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента C4), конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности компонента C4, а именно его C4B изотипа, обладающих хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости использования трудносорбируемого и плохо сохраняющего свою активирующую способность препарата липополисахарида.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата компонента C4

Растворяют аптечный препарат дерината в фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺. В лунки микропанели ряда вносят по 100 мкл того же буфера, содержащего 10 мкл реагента R4 (R4 – сыворотка крови человека, лишенная активности компонента C4 [2]), и анализируемую пробу, содержащую компонент C4 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента CЗ человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата компонента C4 рассчитывают по стандартной кривой.

Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента C4

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, реагент R4 (сыворотку крови человека, лишенную активности компонента C4), конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на чертеже результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента C4 с коэффициентом корреляции R²=0,998, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С4 описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Лахтин М.В., Лахтин В.М., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента C4 комплемента человека. Патент РФ 2253117. Бюл. 15. 27.05.2005.

2. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента C2, C3, C4 и C5. Биоорганическая химия. 1982. Т.8. 5. С.652-659.

Формула изобретения

1. Способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели активатора классического пути комплемента, внесения в лунки микропанели реагента R4 и анализируемой пробы, содержащей компонент С4 комплемента человека с неизвестной активностью, инкубацию, выливание содержимого лунок, внесения конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека, а затем после инкубации и удаления инкубационного раствора внесения субстрата этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента С4 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в качестве активатора классического пути комплемента используют деринат.

2. Набор для определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, реагент R4, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С4.

РИСУНКИ