Патент на изобретение №2376388

(54) НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ БОЛЕЗНЕЙ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР – ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS CORRUGATA МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

(57) Реферат:

Набор синтетических олигонуклеотидов включает праймеры 5′-CGT GTG TTG CTG GGG GAA АС-3′, 5′-GCG GGT TGA GCA AGG TGT ТС-3′ и пробу: (BHQ1)-5′-GGC GAA GCG СТТ GTC C(FdT)T GGG ATT-3T. Посредством ПЦР набор позволяет достоверно обнаруживать в биологическом материале ДНК возбудителя болезней овощных культур – грамотрицательной бактерии Pseudomonas corrugata.

Изобретение относится к области молекулярно-генетической диагностики фитопатогенов.

В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики фитопатогенов, которые позволяют выявлять последовательности ДНК, являющиеся характерными для определенного вида возбудителя инфекционного заболевания. Тем самым обнаруживается соответствующий возбудитель заболевания и делается вывод о его наличии в биологическом материале.

Наиболее перспективным является использование в этих целях метода полимеразной цепной реакции (ПНР) – высокоспецифичный и высокочувствительный метод выявления бактериальной ДНК. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вида возбудителя.

Известно изобретение по заявке 2003121605 (опубликована 27.01.2005), представляющее набор для идентификации энтерогеморрагических Escherihia coli. Это изобретение предполагает проведение ПЦР реакции с участием реагентов, входящих в этот набор. В частности, используются следующие праймеры, специфичные искомым бактериям, которые позволяют обнаружить ДНК этой бактерии при ПЦР:

Rfb for 5′-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTG-3′

Rfb rev 5′-GAGTACATTGGCATGGTGTGG-3′

stx2 for 5′-ATCAGCAATGTGCTTCCGGAG-3′

stx2 rev 5′-CTGAGCACTTTGCAGTAACGG-3′.

В результате обнаруживаются энтерогеморрагические Escherihia coli.

Также известны аналогичные изобретения «Способ и набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания лаймского боррелиоза – borrelia burqdorferi» (заявка 2004105688, опубликована 10.08.2005) и «Набор реагентов для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции» (заявка 2005136997, опубликована 10.06.2007).

Работа над созданием праймеров, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.

1. С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого микроорганизма выбирается участок генома уникальный для данного вида микроорганизмов (или группы видов).

2. На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПНР-реакции (часто 2 праймера и проба).

На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих геномных последовательностей и выборе участка последовательности, где число мутаций соответствует требуемому расположению праймеров.

Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей многих организмов друг с другом, поиск уникальных для нужного микроорганизма участков, не имеющих аналогов у других микроорганизмов.

Поиск соответствия между числом мутаций и расположению праймеров означает, что мутации, возможные в данном микроорганизме (естесственно те, данные о которых уже есть в базах или уже самостоятельно получены), не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.

3. Изготовление праймеров заказывается в особом сервисном центре.

4. С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия данного микроорганизма в биоматериале).

Предлагаемое изобретение позволяет обнаруживать ДНК фитопатогенной бактерии Pseudomonas corrugata, которая вызывает некроз сердцевины стебля томата (Lycopersicum esculentum Mill.) и значительные потери урожая.

Однако аналогичные наборы, а также реакционные смеси, праймеры и способы обнаружения ДНК этой бактерии неизвестны.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанной бактерии в биологическом материале (защищенный грунт, семена, растения, плоды огурца и томата).

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя болезней овощных культур – грамотрицательной бактерии Pseudomonas corrugate, включающего в себя праймеры:

5′-CGT GTG TTG CTG GGG GAA AC-3′

5′-GCG GGT TGA GCA AGG TGT TC-3′

и пробу: (BHQ1)-5′-GGC GAA GCG CTT GTC C(FdT)T GGG ATT-3’P, где

BHQ1 означает присоединенный к 5′-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT – флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ.

1. Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные к участку ДНК Pseudomonas corrugata – гену PhaCl, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (100 мМ Tris-HCl (рН 8.8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0.8% Р40, 20 мМ MgCl₂), внутренний контрольный образец (ВК).

И праймеры, и проба представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома возбудителя, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Проба (тоже специфичная к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, что, в свою очередь, зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Иными словами праймеры обеспечивают течение реакции, проба – проявку ее результатов.

Внутренний контрольный образец (ВК) представляет собой ДНК-последовательность, вносимую в реакцию для оценки эффективности ее протекания. Наработка ВК идет независимо от наработки специфического продукта с помощью отдельных праймеров и проб.

2. Раствор фермента Taq-полимеразы.

3. Положительный контрольный образец – ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом размером 240 п.н. генома Pseudomonas corrugata.

Он вносится в пробирку (по аналогии с исследуемыми образцами) для того, чтобы иметь возможность сравнивать результаты, полученные в опытных пробирках с тем, как должно получаться при “положительной реакции”. Соответственно добавляемые в остальные пробирки образцы ДНК являются опытными.

4. Отрицательный контрольный образец – образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

Данный набор применяется следующим образом.

1. Биологический материал (защищенный грунт, семена, растения, плоды огурца и томата) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки, не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для ПЦР.

2. Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов.

3. Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы.

4. Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок K- (отрицательный контрольный образец), K+ (положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1) ДНК.

5. В пробирку, маркированную K-, вносится отрицательный контрольный образец.

6. В пробирку, маркированную K+, вносится положительный контрольный образец.

7. Все пробирки устанавливаются в блок амплификатора, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим амплификатором автоматически во время амплификации (устройства: амплификаторы детектирующие ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО “НПФ ДНК-Технология”).

Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.

В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными приборами – детектирующими амплификаторами.

Формула изобретения

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК возбудителя болезней овощных культур – грамотрицательной бактерии Pseudomonas corrugata методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры:
5′-CGT GTG TTG CTG GGG GAA АС-3′
5′-GCG GGT TGA GCA AGG TGT ТС-3′
и пробу: (BHQ1)-5′-GGC GAA GCG СТТ GTC C(FdT)T GGG АТТ-3’Р, где BHQ1 означает присоединенный к 5′-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT – флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т.