Патент на изобретение №2376386
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СРЕДА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для ускоренной индикации и дифференциации энтеробактерий. Питательная среда содержит агар-агар, лактозу, маннит, пептон, NaCl, нейтральный красный, бромтимоловый синий и 0,5%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток. Изобретение позволяет расширить арсенал питательных сред. 2 табл.
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к дифференциальной диагностике энтеробактерий, и может быть использовано для ускоренной индикации и дифференциации энтеробактерий, выделенных из биологического материала животных и птиц. Известна питательная среда Левина для выращивания сальмонелл, эшерихий, протеев, стафилококков и грибов рода Candida, содержащая пептон, агар-агар, NaCl, лактозу, двуосновной фосфат калия, индикаторы эозин желтый и метиловый синий – готовится на мясной воде. Однако использование этой питательной среды усложнено тем, что она не подлежит хранению в готовом виде, кроме того, она позволяет дифференцировать лишь три рода представителей семейства энтеробактерий. Наиболее близкой по сущности заявляемому решению является известная политропная полужидкая питательная среда – ГШПС (Лабораторное дело, 1979, Однако эта среда требует большого количества компонентов, что делает ее более дорогой и сложной в приготовлении. Задача данного изобретения – расширение арсенала питательных сред, используемых в бактериологической диагностике. Поставленная задача решается тем, что известная среда для дифференциальной диагностики энтеробактерий, включающая агар-агар, лактозу, маннит, пептон, NaCl, нейтральный красный, бромтимоловый синий и минерально-солевую основу (фосфат натрия, сернокислый аммоний, сернокислый калий, сернокислый магний, углекислый натрий), согласно изобретению в качестве минерально-солевой основы содержит вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток, при следующем соотношении компонентов:
Изобретение осуществляется следующим образом. В качестве заменителя набора солей, применяемых в составе среды, использована древесная зола, полученная из березы, в составе ее содержатся калий, натрий, магний, железо, марганец, медь, цинк. Приготовление среды. Экспериментальную политропную полужидкую питательную среду – ЭПППС – готовят на основе вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, заменяя тем самым минерально-солевую основу среды-прототипа, при этом содержание остальных компонентов остается неизменным. Зола древесины березы (заявка на патент Спектральный анализ древесины березы и вытяжек из ее золы в зависимости от времени года, а также до и после автоклавирования, проведены в лаборатории биохимии доктором с.-х. наук Скуковским Б.А. (ГНУ СибНИПТИЖ СО Россельхозакадемии). Состав макро- и микроэлементов золы древесины березы не зависит от того, в какое время года она была получена. Доказано, что при выдержке от 1 до 2 дней все полученные концентрации содержат меньшее количество макро- и микроэлементов, чем при выдержке от 3 до 4 дней. Кроме того, данный компонент является достаточно дешевым и доступным. Сначала готовят 0,5%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток (1000,0 мл) – для этого берут 6,0 г древесной золы березы, просеянной через сито, и доливают до 1200,0 мл дистиллированной водой, выдерживают 3 суток, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем – через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин. Для дальнейшей работы используют 1000,0 мл готовой вытяжки. 2,5-3,0 г агар-агара предварительно заливают небольшим количеством 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа. Остальную вытяжку подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2. 20,0 г пептона размешивают стеклянной палочкой в небольшом количестве 0,5%-ной вытяжки (50,0-100,0 мл). 0,04 г нейтрального красного растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения). 0,02 г бромтимолового синего растворяют в 0,5 мл спирта. Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшейся 0,5%-ной вытяжкой древесной золы березы, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). Чистые культуры энтеробактерий (музейные штаммы), а также выделенные культуры от больных животных и птиц (подозрительные колонии), выращенные на простых и элективных питательных средах, засевают уколом на испытуемую экспериментальную среду – ЭПППС и контрольную политропную полужидкую питательную среду – ПППС (Лабораторное дело, 1979, Изобретение характеризуется следующими примерами его осуществления Пример 1. Сначала готовят 0,5%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток (1000,0 мл) – для этого берут 6,0 г древесной золы березы, просеянной через сито, и доливают до 1200,0 мл дистиллированной водой, выдерживают 3 суток, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем – через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин. Для дальнейшей работы используют 1000,0 мл готовой вытяжки. Далее 2,5-3,0 г агар-агара заливают небольшим количеством 0,5%-ной вытяжки (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа. Остальную вытяжку подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2. В небольшом количестве 0,5%-ной вытяжки (50,0-100,0 мл) размешивают стеклянной палочкой 20,0 г пептона. Нейтральный красный 0,04 г растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения). Бромтимоловый синий 0,02 г растворяют в 0,5 мл спирта. Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшейся 0,5%-ной вытяжкой, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). На эту среду пробно засевают уколом культуру семейства энтеробактерий (в нашем случае – сальмонеллу). Пример 2. Сначала готовят 1,5%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток (1000,0 мл) – для этого берут 18,0 г древесной золы березы, просеянной через сито, и доливают до 1200,0 мл дистиллированной водой, выдерживают 3 суток, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем – через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин. Для дальнейшей работы используют 1000,0 мл готовой вытяжки. Далее 2,5-3,0 г агар-агара заливают небольшим количеством 1,5%-ной вытяжки (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа. Остальную вытяжку подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2. В небольшом количестве 1,5%-ной вытяжки (50,0-100,0 мл) размешивают стеклянной палочкой 20,0 г пептона. Нейтральный красный 0,04 г растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения). Бромтимоловый синий 0,02 г растворяют в 0,5 мл спирта. Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшейся 1,5%-ной вытяжкой, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). На эту среду пробно засевают уколом культуру семейства энтеробактерий (в нашем случае – сальмонеллу). Пример 3. Сначала готовят 3,0%-ную вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток (1000,0 мл) – для этого берут 36,0 г древесной золы березы, просеянной через сито, и доливают до 1200,0 мл дистиллированной водой, выдерживают 3 суток, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, затем – через бумажный, автоклавируют при 1,5 атм 30 мин. Для дальнейшей работы используют 1000,0 мл готовой вытяжки. Далее 2,5-3,0 г агар-агара заливают небольшим количеством 3,0%-ной вытяжки (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа. Остальную вытяжку подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2. В небольшом количестве 3,0%-ной вытяжки (50,0-100,0 мл) размешивают стеклянной палочкой 20,0 г пептона. Нейтральный красный 0,04 г растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения). Бромтимоловый синий 0,02 г растворяют в 0,5 мл спирта. Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшейся 3,0%-ной вытяжкой, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). На эту среду пробно засевают уколом культуру семейства энтеробактерий (в нашем случае – сальмонеллу). Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 1, 2 и 3, представлены в таблице 1.
Сравнивая результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 1, 2 и 3, можно констатировать, что экспериментальная среда, приготовленная на основе 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток (пример 1), совпадает по изменению цвета среды с контролем, что обусловливает ее дальнейшее применение. Далее проводят испытание экспериментальной политропной полужидкой питательной среды – ЭПППС, приготовленной на основе 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, для выращивания всех штаммов энтеробактерий. Для контроля используют среду – ПППС (Лабораторное дело, 1979, Результаты испытания экспериментальной политропной полужидкой питательной среды – ЭПППС, приготовленной на основе 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, представлены в таблице 2.
Сравнивая результаты испытания экспериментальной среды с контрольной, можно констатировать, что экспериментальная среда, приготовленная на основе 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, равноценна контрольной, что дает основание для ее использования в практике. Таким образом, введение в среду для дифференциальной диагностики энтеробактерий минерально-солевой основы в виде 0,5%-ной вытяжки древесной золы березы, выдержанной в течение 3-х суток, значительно сокращает количество компонентов, упрощает ее приготовление, удешевляет и сокращает сроки диагностических исследований.
Формула изобретения
Среда для дифференциальной диагностики энтеробактерий, включающая агар-агар, лактозу, маннит, пептон, NaCl, нейтральный красный, бромтимоловый синий и минерально-солевую основу, отличающаяся тем, что в качестве минерально-солевой основы содержит вытяжку древесной золы березы, выдержанную в течение 3-х суток, при следующем соотношении компонентов:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
8, с.492-494. Под ред. ПОКРОВСКОГО В.И., Энтеробактерии. Руководство для врачей. – М.: Медицина, 1985, с.269-271. SU 422769 А1, 05.04.1974. SU 737452 A1, 03.06.1980. RU 2267529 C2, 10.01.2006. SU 1049541 A1, 23.10.1983. RU 2300559 C2, 10.06.2007.