Патент на изобретение №2376365

(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается способа культивирования микобактерий туберкулеза. Способ предусматривает измельчение патологического материала до образования суспензии, заливку 6%-ным раствором серной кислоты, центрифугирование, отмывку и ресуспендирование осадка физиологическим раствором, озонированным в концентрации 0,25-0,5 мг/л озона. Полученный материал высевают на плотную питательную среду, подходящую для роста. Использование изобретения позволяет ускорить рост микобактерий, повысить выделяемость последних из патологического материала и, как следствие, эффективность диагностики. 2 табл.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способу культивирования микобактерий туберкулеза, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных лабораториях для ускорения постановки диагноза на туберкулез.

Известен способ культивирования микобактерий на плотных питательных средах Левенштейна-Йенсена, ФАСТ-3Л, Финн-2, Гельберга, Петраньяни. Подготовленный для исследования материал высевают в 5-10 пробирок с питательной средой Левенштейна-Йенсена и одну из сред: Гельберга, Петраньяни, Финн-2, ФАСТ-3Л. Посев проводят пастеровской пипеткой или платиновой петлей. Засеянные пробирки укладывают в наклонном положении и помещают в термостат с температурой 37-38°С. Через 2 суток посевы просматривают и определяют восстановление цвета среды. Если цвет среды не восстановился, обработку и посев повторяют. Пробирки, в которых появился рост посторонней микрофлоры, удаляют. В остальных ватно-марлевые пробки парафинируют. Посевы инкубируют в течение 3 месяцев. (Наставление по диагностике туберкулеза животных. – М., 2004. – С.25-36). По мнению многих исследователей, бактериологическое исследование при постановке диагноза на туберкулез – длительный процесс. Рост микобактерий бычьего вида чаще обнаруживают на 20-60 сутки, человеческого – на 20-30, птичьего – на 10-20, атипичных микобактерий – на 3-30 сутки. Сокращение срока культивирования микобактерий туберкулеза является важным.

В научной литературе описаны свойства озонированных растворов, которые находят все больше применение в медицине и ветеринарии. Действие озонированного физиологического раствора на микроорганизмы проявляется в зависимости от дозы озона в растворе и длительности его воздействия. Известно, что добавление озона в небольших количествах (до 0,005 мг/л) в жидкие питательные среды приводит к стимуляции роста выращиваемых на них бактериальных культур (В.И.Пантелеев, И.П.Погорельский, М.К.Бакулин. Санитарно-микробиологические аспекты использования озона при обеззараживании питьевой воды / Вятский медицинский вестник. – 1999. – 2. – С.66-68).

Бактерицидное и бактериостатическое действие растворенного озона на различные штаммы микобактерий туберкулеза также зависит от дозы озона и времени обработки (А.А.Приймак, А.Н.Калюк, А.Г.Киргинцев. Воздействие озоно-кислородной смеси на микобактерий туберкулеза и условно-патогенные микроорганизмы / Пробл. туб. – 1991. – 4. – С.7-10).

Механизм действия озона заключается в воздействии озона на клеточные мембраны бактерий, вызывая окисление и образование пероксидов из фосфолипидов и липопротеинов клеточной мембраны бактерий, при высоких концентрациях происходит ее разрыв. Низкие концентрации озона (до 0,5 мкг/мл) стимулируют дыхание и репродуктивную способность клеток микро- и макроорганизмов. (С.В.Конев, В.К.Матус. Озонобиология: молекулярно-мембранные основы./ 1-я Всероссийская научно-практическая конференция «Озон в биологии и медицине». – Н.Новгород. – 1992. – С.3-4).

Задачей изобретения является ускорение роста микобактерий на плотных питательных средах, повышение выделяемости и эффективности диагностики.

Задача достигается путем использования суспензии микобактерий туберкулеза, а также суспензии из патологического материала, которую готовят по методу Гона, Аликаевой, как описано в Наставлении (см. «Наставление по диагностике туберкулеза животных», 2002). Подготовка биоматериала состоит из следующих этапов.

Кусочки лимфатических узлов и органов измельчают и растирают пестиком со стерильным песком до гомогенной массы.

Заливают 6%-ным раствором серной кислоты в соотношении 1:4 и тщательно перемешивают.

Пробы центрифугируют 15 минут при 3000 об/мин.

Полученную надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют и дважды отмывают физиологическим раствором, центрифугируя 5 минут при 3000 об/мин. Предложенный способ отличается тем, что используют озонированный физиологический раствор с концентрацией растворенного озона 0,25-0,5 мг/л, приготовленный прямым барбатированием озоно-кислородной смесью на синтезаторе озона А-с-ГОКСф-5-04-ОЗОН.

Ресуспензированный озонированным физиологическим раствором осадок высевают в 5-10 пробирок с питательной средой Левенштейна-Йенсена. Посев проводят пастеровской пипеткой или платиновой петлей. Засеянные пробирки укладывают в наклонном положении и помещают в термостат с температурой 37-38°С. Посевы инкубируют 30 дней и регистрируют начало и интенсивность роста микобактерий туберкулеза ежедневно до 21 дня и на 30 день. При отсутствии роста микобактерий пробирки продолжают инкубировать и вести наблюдение в течение 3 месяцев.

Сущность изобретения поясняется на конкретном примере выполнения способа.

Пример 1. Определение оптимальной концентрации озона для стимуляции скорости и интенсивности роста микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах.

Физиологический раствор озонировали прямым барбатированием озоно-кислородной смесью на синтезаторе озона А-с-ГОКСф-5-04-ОЗОН. Синтезатор озона предназначен для получения озоно-кислородной смеси с концентрацией озона на выходе аппарата до 50 мг/л из газообразного кислорода (ГОСТ 5583-78) путем электросинтеза. Озоно-кислородная смесь, получаемая в синтезаторе, предназначена для использования в медицинских целях и проведения научно-исследовательских работ по использованию озона в экологии, биологии, медицине и ветеринарии с целью отработки научно-обоснованных методик применения озона. Синтезатор озона представляет собой автоматизированный прибор непрерывного действия. Концентрация озона в озоно-кислородной смеси регулируется за счет изменения частоты питающего озонатор напряжения, а также за счет изменения расхода кислорода, продуваемого через озонатор.

Флакон с нужным количеством физиологического раствора соединяют со штуцером прибора через озоностойкую трубку и устанавливают прибор в режим получения озонированного физиологического раствора с необходимой концентрацией растворенного озона. Готовят суспензию M.bovis штамм 14 на озонированном физиологическом растворе, концентрации которого составляют 0,1; 0,25; 0,5 и 1 мг/л. Каждую пробу суспензии микобактерий засевают в 5 пробирок с плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена и ведут учет начала и интенсивности роста ежедневно до 21 и на 30 день. Скорость появления первичного и интенсивного роста микобактерий в зависимости от концентрации озона в суспензии показана в таблице 1.

Из таблицы видно, что концентрация озона 0,1 мг/л не только не стимулирует, но тормозит первичный рост микобактерий (р<0,05), тогда как концентрация озона 0,25 и 0,5 мг/л стимулирует (р<0,001) первичный и интенсивный рост, причем первичный рост регистрируется на 5-7 сутки, интенсивный – 10-12 сутки, а в контрольных пробирках соответственно – 10-15; 21-23 сутки. Концентрация озона 1,0 мг/л тормозит первичный рост микобактерий (р<0,01) и не изменяет интенсивность роста (р>0,05). Появление первичного роста микобактерий регистрируют на 16-18 сутки.

Таким образом, опытным путем установлено, что оптимальная концентрация озона для ускорения и повышения интенсивности роста микобактерий является концентрация 0,25-0,5 мг/л. Существенных различий в культивировании микобактерий на различных питательных средах с использованием озонированного физиологического раствора не установлено.

Пример 2. Определение скорости и интенсивности роста микобактерий M.bovis штамм 14, изолированного из биологического материала морских свинок.

Десять морских свинок инфицируют суспензией культуры M.bovis штамм 14 подкожно в дозе 1 мг/мл. Через 30 дней после заражения животных убивают и при патологоанатомическом исследовании устанавливают индекс пораженности по 4-бальной системе у каждого животного и по группе (Г.Ф.Коромыслов, Н.П.Овдиенко, В.А. Шаров и другие. Методические рекомендации по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных / М.:ВИЭВ, 1992. С.-74-76). Мазки-отпечатки внутренних органов животных готовят по 3 мазка на предметных стеклах и окрашивают по Цилю-Нильсену. Под иммерсией просматривают 50-100 полей зрения каждого мазка. Результаты исследований показали, что все морские свинки были больны туберкулезом, индекс пораженности составил 18,6 баллов.

Затем проводят посев биоматериала от морских свинок на среде Левенштейна-Йенсена по общепринятой методике и с использованием озонированного физиологического раствора при концентрации в нем 0,25-0,5 мг/л озона.

Результаты изучения скорости появления первичного роста представлены в таблице 2.

Таблица 2. Рост культуры из штамма 14 M.bovis на среде Левенштейна-Йенсена
п/п	Биоматериал от морских свинок, проба	Первичный рост, сутки (M±m)	Интенсивность роста, число колоний на 21 сутки (М±m)
+озон (О3)	Контроль	+озон (О3)	Контроль
1	1	11,8±0,2	19,6±0,24	23,0±3,99	7,8±1,46
2	2	11,8±0,2	19,4±0,24	21,6±2,01	10,2±0,99
3	3	11,8±0,2	19,4±0,24	25,2±2,03	7,2±1,91
4	4	12,0±0,01	19,2±0,2	27,0±3,05	9,0±1,22
5	5	11,6±0,24	19,4±0,24	23,2±3,99	7,8±0,86
6	6	11,4±0,24	19,4±0,24	21,8±2,96	9,8±0,66
7	7	11,8±0,2	19,4±0,24	21,2±2,37	7,8±1,5
8	8	11,8±0,2	19,6±0,24	23,6±2,16	9,4±0,86
9	9	11,6±0,24	19,4±0,24	24,0±2,6	6,6±1,12
10	10	11,6±0,24	19,2±0,2	24,4±3,93	7,2±1,83
По группе	11,7±0,2	19,4±0,23	23,5±2,91	8,28±1,24

Из таблицы видно что, первичный рост микобактерий при использовании озонированного физиологического раствора проявляется на 11,7±0,2 сутки, в контроле на 19,8±0,23 сутки (р<0,001).

По результатам изучения интенсивности роста культуры из биоматериала от инфицированных морских свинок на 21 сутки видно что, интенсивность роста колоний микобактерий при добавлении озонированного физиологического раствора составила 23,5±2,91, а в контроле 8,28±1,24.

Предлагаемый способ культивирования микобактерий туберкулеза ускоряет и повышает интенсивность роста микобактерий 1,8-2 раза, тем самым сокращает сроки постановки диагноза на туберкулез.

Формула изобретения

Способ культивирования микобактерий туберкулеза, включающий приготовление суспензии патологического материала: измельчение, заливку 6%-ным раствором серной кислоты, центрифугирование, отмывание, ресуспендирование осадка физиологическим раствором, посев на плотную питательную среду, отличающийся тем, что отмывают и ресуспендируют осадок патологического материала физиологическим раствором, который озонируют в концентрации 0,25-0,5 мг/л озона.