Патент на изобретение №2376317

(54) ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК ДЛЯ НЕВИРУСНОГО ТРАНСГЕНЕЗА, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН SSBTne И СИГНАЛ ЯДЕРНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ VirD2

(57) Реферат:

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к невирусному трансгенезу клеток, и может быть использовано в медицинской и сельскохозяйственной биотехнологии для доставки экзогенов. Конструируют белок, включающий ДНК связывающий домен SSBTne из термофильного микроорганизма Termatoga neapolitana, присоединенный к С-концу домена VirD2 из Agrobacterium tumefaciens, являющегося сигналом ядерной локализации. Изобретение обеспечивает эффективный транспорт трансгена в клеточное ядро. 6 ил., 1 табл.

I. Описание изобретения

Одной из важнейших задач биотехнологии является повышение адресности доставки и эффективности интеграции чужеродных генов при трансфекции эукариотических клеток.

Понятно, что векторы для транспорта генов должны преодолевать многочисленные физиологические барьеры, например внутриклеточные барьеры:

– невозможность самостоятельного выхода нуклеиновой кислоты из эндосомы,

– деградация нуклеиновой кислоты в лизосомах вследствии длительного их пребывания в эндосоме,

– неспособность нуклеиновой кислоты к самостоятельному направленному транспорту в ядро клетки.

Именно наличие этих барьеров приводит к низкой эффективности микроинъекции и к малой эффективности трансфекции клеточных культур. До недавнего времени большинство протоколов транспорта генов включало доставку экзогенов посредством вирусных векторов.

Однако ряд очевидных недостатков вирусных векторов побуждал искать альтернативные невирусные системы, в качестве которых в настоящее время чаще всего используются различные липосомные агенты. Но липосомная доставка также имеет ряд недостатков – липосомы не решают проблему вышеперечисленных барьеров.

Предполагается, что будущие невирусные векторные системы для транспорта генов должны сочетать в себе как элементы вирусных векторов, так и невирусных систем, при этом речь будет идти уже не о вирусном или липосомном транспорте генов, а, скорее, о виросомной доставке.

Новые возможности в решении данных вопросов были получены благодаря активному изучению механизмов агробактериальной трансформации и вирусной инфекции клеток. Наиболее интересными с этой точки зрения являются два механизма, облигатно присутствующих практически у всех вирусных и бактериальных внутриклеточных паразитов, а именно наличие ДНК связывающих белков, способных противодействовать нуклеазам хозяйской клетки, и наличие сигналов ядерной локализации (NLS), обладающих кариофильными свойствами, т.е. способностью адресно протаскивать паразитическую ДНК в ядро хозяйской клетки.

Т.е. одним из вариантов преодоления вышеперечисленных барьеров для доставки может стать использование в целях трансфекции, в дополнение к таким системам как липосомы, вирусных и бактериальных белковых агентов, которые позволили бы, с одной стороны, защитить экзоген, а, с другой стороны, адресовать встройку трансгена в целевой геном. Таким образом, нашей целью стало создание новых невирусных векторных систем для доставки экзогенов на базе вышеперечисленных механизмов ДНК-связывания и сигналов ядерного тпранспорта.

Изобретением является химерный рекомбинантный белок, включающий ДНК связывающий домен SSBTne из Termatoga neapolitana, присоединенный к С-концу домена VirD2 из Agrobacterium tumefaciens, являющегося сигналом ядерной локализации, который как изобретение относится к области «генной инженерии» и «биотехнологии».

Прототипом предлагаемому изобретению являются ДНК связывающий домен SSBTne и сигнал ядерной локализации VirD2 как автономные белковые конструкции [1; 2].

Отличительная сущность изобретения заключается в том, что сконструированный белок VirD2-SSBTne (фиг.1) обладает трансфецирующей способностью и способностью повышать эффективность липосомальной трансфекции.

Технический результат, достигаемый настоящим изобретением, заключается в том, что полученная белковая конструкция, включающая ДНК связывающий домен SSBTne и сигнал ядерной локализации VirD2, способна как самостоятельно выступать в роли вектора при трансфекции клеток эукариот, так и повышать эффективность липосомальной трансфекции. Основная цель: получение высокоочищенного нативного белка VirD2 -SSBTne и изучение его базовых свойств.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

– получение генной конструкции, кодирующей целевой белок,

– оптимизация плазмидных векторов, в которые встраивались генные конструкции,

– наработка генов в препаративных количествах в клонирующих векторах,

– получение высокоочищенного целевого белка.

Источники клонируемого материала:

1) Ген ДНК-связывающего белка SSBTne из археобактерии Termatoga neapolitana [1].

2) Ген сигнала ядерной локализации или ядерного транспорта VirD2 из агробактерии Agrobacterium tumefaciens [2].

Схема клонирования по этапам.

Ген SSBTne был получен на основе известной последовательности ДНК-связывающего белка SSBTne из археобактерии Termatoga neapolitana посредством ПЦР [(94°С – 2 мин; 60°С – 30 с; 72°С – 1 мин) X 30; 72°С – 5 мин] с корректирующими праймерами (см. табл. 1). Ген VirD2 был собран на основе известной последовательности сигнала ядерной локализации из корректирующих олигонуклеотидов (см. табл. 1 перечень последовательностей). Далее посредством лигатирования ген SSBTne был встроен в плазмидный вектор pQE6, а ген VirD2 был встроен в цлазмидный вектор pQE16 фирмы Quageen (см. перечень последовательностей 1; 2).

Лигатирование конструкций, гидролизованных по соответствующим рестрикционным сайтам, проводилось по 4-компонентной схеме: 10×буфер для лигатирования, 250 мМ KCl, 10×Нех, 10×АТФ. Продолжительность лигатирования лигазой фага Т4 составляла 24 часа при температуре +4°С. Далее компетентные клетки E.coli М15 (nal^s, str^s, rif^s, lac^–, ara^–, gal^–, mtl^–, F’^–, recA⁺, uvr⁺, lon⁺, pREP4 – kanamycin resistance 25 мг/мл) трансформировались лигазными смесями методом электропорации при следующем режиме: 2,5 kV, 25 mF в течение 4 с, после чего они высевались на агаризованную питательную среду LB с соответствующими антибиотиками (ампициллин; канамицин) для селекции. На следующие сутки проводился пересев отобранных клонов как на сектора агаризованной питательной среды, так и в жидкую питательную среду LB с соответствующими антибиотиками для последующего скрининга плазмидной ДНК, которая выделялась методом щелочного лизиса. Правильность сборки генов, кодирующих химерные белковые конструкции, подтверждалась рестрикционным анализом и секвенированием на автоматическом секвенаторе ALF express II (Amersham Biosciences corp., США) (последовательности соответствовали теоретическим). Были получены плазмидные конструкции: pQeSSBTne, pQeVirD2, pGD-1 (см. перечень последовательностей 3; 4; 5).

Для экспрессии белков был использован экспрессионный штамм Е.coll M15. Индукция экспрессии осуществлялась путем добавления к клеточной культуре с оптической плотностью 0,9-1,2 (550 нм) индуктора ИПТГ (изопропил--D-тиогалактопиранозид) в концентрации 0,1 мМ. Время индукции составляло 3,0 часа.

В препаративных количествах белок выделялся посредством фракционирования методом гельфильтрации. 1,5 л индуцированной культуры осаждались при 4000 об/мин 30 мин, осадок выдерживался при -70°С сутки, затем осадок промывался 100 мл Н₂O MQ и ресуспендировался в 40 мл рабочего буфера Buf.B (Tris Cl, рН 7,4; KCl 50 mM.; EDTA 1 mM; Tween 20, 0,5%; Triton X100, 0,5%).

Затем добавлялся лизоцим до ослизнения, осадок выдерживался 15 мин при 0°С. Затем раствор обрабатывался УЗ в мягком режиме во льду, после чего добавлялись ДНКаза и РНКаза (1 мл/40 мл лизата), и осуществлялся прогрев на водяной бане при 75°С в течение 45 мин, при этом благодаря наличию термостабильного домена целевой белок полностью сохранял свои свойства и концентрировался в супернатанте в растворимом виде, в то время как большинство штаммовых белков коагулировали, что значительно упрощало последующую его очистку методом гельфильтрации. Далее производилось центрифугирование (4000 об/мин 40 мин 3°С) и супернатант переносили в чистую пробирку через фильтр (0.45 µm) (перед этим отбирались 1,5 мл в качестве контроля после ЦФ). Т.к. оптимальным отношением объема колонки к объему наносимого образца является V_к/V_о=40 [3], то препарат был сконцентрирован посредством диализа в Sefadex G-50 (Sigma, USA) до 7 см³. Колонка V=300 см³ заполнялась сорбентом Sefadex G-75 (Sigma, USA), промывалась 3-мя объемами рабочего буфера при скорости потока в 9 см³/мин (Р=0,15 МПа или 1,5 бара), после чего ее уравновешивали 5-ю объемами рабочего буфера. 7 см³ образца наносили на колонку. При скорости элюирования 19 см³/ч проводили сбор фракций, ориентируясь на данные самописца и спектрофотометра 50 (nm). Посредством электрофореза в 17% полиакриламидном геле (фиг.2) было доказано, что целевой белок вышел во фракциях X-XI.

Таким образом, был получен высокоочищенный химерный двудоменный белок VirD2-SSBTne (а.к. последовательность см. в перечне последовательностей 6) с молекулярным весом 23 кДа и концентрацией 2 мг/мл, который будет использован для дальнейших исследований в области усовершенствования методов невирусной трансфекции клеток эукариот.

На следующем этапе были изучены базовые свойства белка VirD2-SSBTne, именно эти свойства и определяли способен ли он войти в состав трансфецирующего реагента.

Сначала изучались ДНК – связывающие свойства исследуемых белков ViRD2-SSBTne по методу ретардации в агарозном геле, т.к., связываясь с ДНК, белки утяжеляют ее.

Предварительно белки связывались с фрагментами ДНК при температуре 94°С с целью образования одноцепочечных форм ДНК.

На форезе (фиг.3) виден четкий сдвиг ДНК-белковых комплексов относительно голой ДНК, при этом наиболее четкая ретардация наблюдается на 2-ом треке, при этом оптимальные молярные соотношения нуклеиновой кислоты и белка составляют 1:50, соответственно.

Затем была изучена способность полученных белков защищать ДНК от воздействия ДНКазы. ДНК смешивалась при температурном оптимуме с нашим белком, затем добавлялась ДНКаза в кол-ве 3 мкл и результат оценивался относительно положительного и отрицательного контролей в агарозном геле (фиг.4). Было видно (на 1-м) треках, что ДНК в присутствии наших белков не подвергалась разрушающему воздействию ДНКазы, т.е. наши белки обладали выраженными нуклеазпротективными свойствами. В качестве репортерного функционального гена был выбран ген белка GFP под контролем CMV промотера в составе коммерческого челночного вектора pCECMVGFP (перечень последовательностей приложения 7).

Были разработаны и оптимизированы реагенты для трансфекции на базе катионных липосом (липофектин) и полученных белковых конструкций. Т.е. был подобран наиболее физиологичный буфер, которым оказался фосфатный буфер PBS, был подобран фоновый ионный состав, в качестве которого выступали ионы Mg2+ и Zn2+, благодаря своему стабилизирующему воздействию на наши белки, а также было определено оптимальное объемное соотношение ДНК-белкового комплекса и липофектина (1:1).

На завершающем этапе была проведена трансфекция клеточных линий Cos-1 и Нер-2 нашими трансфецирующими реагентами, далее был проведен статистический учет результатов трансфекции посредством флюоресцентной микроскопии с последующим фотодетектированием, в результате чего было доказано, что конструкция VirD2-SSBTne сама по себе обладает векторными свойствами, определяя достоверный выход трансфекции на уровне 5%, а так же детерминирует достоверное (Р>0,999) увеличение эффективности липосомальной трансфекции клеток Cos-1 и Нер-2 в 2 раза (с 15-25% до 30-50%) (фиг.5).

Подписи к фиг.2

Результаты электрофореза в 17% ПААГ в присутствии SDS

1. Штамм E.coli М15 (VirD2-SSBTne) до индукции IPTG (без прогрева)

2. Штамм E.coli М15 {VirD2-SSBTne) индукция IPTG (без прогрева)

3. Штамм E.coli Ml5 (VirD2-SSBTne) до инд. IPTG термолизис (75°С 45 мин)

4. Штамм E.coli М15 (VirD2-SSBTne) инд. IPTG термолизис (75°С 45 мин), (проба до гельфильтрации)

5. Фракция белка X (после гельфильтрации)

6. Фракция белка XI (после гельфильтрации)

7. Маркер молекулярного веса (30 кДа).

Подписи к фиг.3

Ретардация ДНК-белкового комплекса в 1,5% агарозном геле

1. ДНК, свободная

2. ДНК: Белок 1:50

3. ДНК: Белок 1:25

4. ДНК: Белок 1:12,5

Подписи к фиг.4

Электрофорез в 1,5% агарозном геле (изучение нуклеазпротективных свойств VirD2-SSBTne).

1. ДНК+ДНКаза+VirD2-SSBTne

2. маркер мол. веса лямбда

3. ДНК без ДНКазы

4. ДНК+ДНКаза

5. ДНК+ДНКаза (дубль)

Подписи к фиг.5

Учет результатов трансфекции клеток линии Нер-2 комплексом pCECMVGFP и [VirD2-SSB]-LP. а) pCECMVGFP+буф.PBS, б) pCECMVGFP+LP+буф.PBS, в) pCECMVGFP+[VirD2-SSB], г) pCECMVGFP+[VirD2-SSB]+LP.

Подписи к фиг.6

Учет результатов трансфекции клеток линии Cos-1 комплексом pCECMVGFP и [VirD2-SSB]-LP. а) pCECMVGFP+буф.PBS, б) pCECMVGFP+LP+буф.PBS, в) pCECMVGFP+[VirD2-SSB], г) pCECMVGFP+[VirD2~SSB]+LP.

Перечень последовательностей

Литература

3. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. – издат. «Наука», 1981.

Формула изобретения

Химерный рекомбинантный белок для доставки экзогенов при трансфекции клеток эукариот, включающий ДНК-связывающий домен SSBTne из термофильного микроорганизма Termatoga neapolitana, присоединенный к С-концу домена VirD2 из Agrobacterium tumefaciens, являющегося сигналом ядерной локализации, где позиционируемый белок обладает аминокислотной последовательностью, приведенной в перечне последовательностей 6 описания.

РИСУНКИ