Патент на изобретение №2376020

(54) СРЕДСТВО, ПРОЯВЛЯЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, в частности фармации, и касается нового противоопухолевого средства, представляющего собой билигандный комплекс ванадила с яблочной кислотой – бис(L-малато)оксованадий (IV). 7 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области медицины и касается расширения арсенала потенциальных противоопухолевых средств на основе комплекса оксованадия с органическим лигандом.

Микроэлемент ванадий рассматривается в настоящее время как важный регулятор роста, дифференцировки и гибели клеток. Ванадийсодержащие соединения представляют интерес и как потенциальные терапевтические агенты, поскольку многие из них проявляют инсулиноподобную [1] или противоопухолевую активность [2]. Для некоторых соединений оксованадия (IV), таких как бис(мальтолато)оксованадий (IV) и бис(ацетилацетонато)оксованадий (IV), являющихся эффективными инсулиномиметиками, описана и антипролиферативная активность в отношении целого ряда линий опухолевых клеток человека [3]. Исследования последних лет показали, что как неорганические соединения четырех- или пятивалентного ванадия, так и целый ряд его комплексов с органическими лигандами, в составе которых валентность ванадия изменяется от 3 до 5, обладают цитостатической активностью, подавляя рост опухолевых клеток in vitro и in vivo [4, 2, 5]. Так, соединения ванадия проявляют выраженный противоопухолевый эффект в отношении рака печени мыши, асцитной опухоли Эрлиха, карциномы молочной железы мыши [6], гепатомы Морриса [5], лейомиосаркомы крысы [7], некоторых линий опухолевых клеток человека [8-10]. Общим для различных соединений ванадия является их способность стимулировать апоптоз в неопластических клетках. Показано, что добавление в питьевую воду животным метаванадата аммония индуцирует апоптоз в неопластических клетках, не оказывая при этом никакого влияния на нормальные пролиферирующие клетки [11]. Комплекс 4-валентного ванадия (бис(4,7-диметил-1,10-фенантролин) сульфатооксованадий (IV))-метван намного более эффективно вызывает апоптоз лейкозных клеток от пациентов с различными формами лейкемии, чем такой стандартный химиотерапевтический агент, как винкристин. Кроме того, метван высокоэффективен в отношении резистентных к цисплатину линий клеток раковых опухолей яичников и тестикул [12, 9].

Исследования, проведенные на различных клеточных линиях, позволили сделать вывод о том, что соединения ванадия проявляют противоопухолевый эффект путем ингибирования тирозинфосфатаз, участвующих в передаче внутриклеточных сигналов. Этот эффект в конечном счете приводит к усилению апоптоза или к активации генов – супрессоров опухолей. Ингибирование фосфорилирования тирозина в белках, вызываемое соединениями ванадия, может также подавлять инвазию и метастазирование опухолевых клеток.

Имеющиеся в настоящее время экспериментальные данные позволяют говорить о том, что соединения ванадия могут проявлять (а) антипролиферативный эффект (т.е. подавлять скорость роста раковых клеток); (б) обладать цитотоксическим и (или) цитостатическим действием, обусловленным некрозом или апоптозом; (в) снижать инвазивный или метастатический потенциал малигнезированных клеток; (г) подавлять клеточную резистентность по отношению к химиотерапевтическим агентам [2].

Природа органического лиганда в молекуле ванадийсодержащего соединения во многом определяет его цитотоксическое (противоопухолевое) действие и в то же время цитотоксичность каждого конкретного соединения ванадия варьирует по отношению к различным видам опухолевых клеток. В этой связи актуальным является поиск новых эффективных и нетоксичных соединений ванадия, который продолжается в настоящее время во многих исследовательских центрах.

Известен билигандный комплекс ванадила с яблочной кислотой – бис(L-малато)оксованадий(IV) (VO(mal)₂) [Патент 2101287, 1998 г.], который прошел доклинические испытания в качестве гипогликемического агента [13].

Яблочная кислота, входящая в состав исследуемого комплекса, является естественным метаболитом и может стать дополнительным источником накопления энергии в клетке.

Сущность изобретения состоит в обнаружении противоопухолевой активности бис(L-малато)оксованадия (IV).

Целевое соединение бис(L-малато)оксованадий (IV) получают в 2 стадии взаимодействием L-яблочной кислоты (2 моля) с ванадилирующим агентом (ванадилацетатом) (1 моль) в водной среде, в результате чего образуется первичный ванадильный комплекс L-яблочной кислоты в смеси со свободной L-яблочной кислотой.

Реакционную смесь удалением воды переводят в твердофазное состояние, и полученный твердый раствор первичного ванадильного комплекса [(L-малато)оксованадия (IV)] в L-яблочной кислоте с целью получения целевого соединения бис(L-малато)оксованадия (IV) подвергают нагреванию при 105-115°С (Схема 1) при пониженном или атмосферном давлении.

Строение полученного комплекса подтверждено результатами элементного анализа, а также данными масс-спектрометрии.

Пример 1. Бис(L-малато)оксованадий (IV) (1).

В раствор 50,9 г (0,38 моль) L-яблочной кислоты в 250 мл воды вносят 35,2 г (0,19 моль) ацетата ванадила. Реакционную смесь перемешивают при 40-60°С до полного растворения осадка. Темно-голубой реакционный раствор упаривают досуха на роторном испарителе и полученный промежуточный темно-синий стекловидный продукт высушивают до постоянного веса в вакуум-эксикаторе. Высушенный продукт измельчают и нагревают в той же реакционной колбе на роторном испарителе при 105-115°С (температура в массе) в вакууме водоструйного насоса в течение 1-1,5 ч, процесс сопровождается выделением воды (5-7 г). Полученный бис(L-малато)оксованадий (IV) 1 представляет собой хрупкую темно-синюю пористую массу, выход 58-61 г (96-98%), содержит 1-2% свободной яблочной кислоты.

Бис(L-малато)оксованадий (IV) легко растворим в воде, слабо растворим метаноле и диметилсульфоксиде, почти не растворим в метаноле, не растворим в ацетоне.

Найдено, %: V 15,35; С 28,50; Н 3,32. Брутто-формула: C₈H₁₀O₁₁V.

Вычислено, %: V 15,30: С 28,84; Н 3,03.

Молекулярная масса (m/e) 333 (ионизация электроспреем).

Удельное оптическое вращение []²⁰-164° (вода), (вода, с 1,65).

Пример 2. Бис(L-малато)оксованадий (IV) (1).

Промежуточный продукт, полученный по методу А (1,0 г), нагревают при 97-100°С в течение 24-30 часов. Выход комплекса 0,93 г (99%), который идентичен по физико-химическим характеристикам продукту, полученному в примере 1.

В опытах in vitro исследовали влияние оксованадиевого комплека L-яблочной кислоты (VO(mal)₂) на рост нормальных фибробластов кожи человека, трансформированных вирусом фибробластов мыши NIH 3Т3, трансформированных вирусом клеток почки человека 293, клеток фибросаркомы мыши L 929, клеток феохромоцитомы крысы PC12 и карциномы печени человека HepG₂. Изучение цитотоксичности и противоопухолевой активности оксованадиевых комплексов проводили в сравнении с неорганическим соединением четырехвалентного ванадия -ванадилсульфатом (VOSO₄).

Культура клеток. Клетки PC12 и L929 были получены из Института морфологии человека и животных PAMH, клетки HepG₂ – из Института канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, клетки NIH 3Т3 и 293 получены из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Нормальные фибробласты кожи человека были получены из Института ревматологии РАМН.

Клетки PC12 культивировали в среде RPMI 1640, клетки HepG₂, L929, NIH 3Т3 и 293 – в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, фибробласты кожи здорового человека в среде Игла с добавлением 20% бычьей сыворотки. Среды содержали 2 мМ L-глутамина и гентамицин в концентрации 50 мг/мл. Клетки культивировали в 48-луночных планшетах в СО₂-инкубаторе при 37°С до состояния плотного монослоя.

Цитотоксичность соединений ванадия изучали в интервале концентраций от 0,5 до 24 мкг/мл, используя МТТ-тест. Этот тест, основанный на способности митохондриальных дегидрогеназ образовывать кристаллы формазана из МТТ-реактива (3-[4,5-диметилтиа-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромида), позволяет точно определить число живых клеток.

Исследование действия различных концентраций VO(mal)₂ на рост нормальных фибробластов кожи показало, что через 24 часа после добавление VO(mal)₂ в концентрации от 0,5 до 6,0 мкг/мл жизнеспособность фибробластов не изменялась по сравнению с контролем. В то же время ванадилсульфат проявляет дозозависимое цитотоксическое действие, начиная с самой низкой концентрации (табл.1). Таким образом, VO(mal)₂ не проявляет цитотоксичности по отношению к нормальным клеткам. Увеличение времени инкубации фибробластов в присутствии как VO(mal)₂, так и VOSO₄ приводит к некоторой стимуляции пролиферации.

При исследовании действия VO(mal)₂ на клетки фибросаркомы L929 обнаружено дозозависимое уменьшение числа жизнеспособных клеток по сравнению с контролем, которое усиливается с увеличением времени инкубации. Через 72 часа культивирования VO(mal)₂ в концентрации 6 мкг/мл подавляет рост клеток на 74%. Такой же эффект вызывает и VOSO₄ (табл.2).

Клетки PC12 также чувствительны к цитотоксическому действию VO(mal)₂, которое проявлялось уже через 24 часа инкубации (табл.3).

Для выяснения значения органического лиганда в проявлении цитотоксического действия был исследован также монокомплекс ванадила с яблочной кислотой (L-малатооксованадий) (IV) – VO(mal). Оказалось, что в отличие от биокомплекса VO(mal) во всех исследуемых концентрациях практически не влияет на рост клеток PC12 в течение 24 часов. Через 48 часов культивирования (табл.3) в присутствии монокомплекса наблюдается стимуляция роста этих клеток.

Дозозависимое снижение жизнеспособности в присутствии VO(mal)₂ наблюдалось и для клеток NIH 3Т3 (табл.4).

Клетки HepG₂ менее чувствительны к соединениям ванадия по сравнению с другими линиями трансформированных клеток. Так, цитотоксическое действие VO(mal)₂ на клетки HepG₂ проявляется только через 72 часа культивирования. При инкубации в течение 96 часов число клеток снижается на 40% по сравнению с контролем. Ванадилсульфат в той же концентрации уменьшает число живых клеток приблизительно на 30% только через 96 часов инкубации (табл.5). Эти клетки оказались резистентными к действию комплексов ванадила, в состав которых входят стериоизомеры яблочной кислоты: ванадильные комплексы D-яблочной кислоты (хирального антипода L-яблочной кислоты) и рацемической формы DL-яблочной кислоты (данные не приведены).

В табл.6 представлены значения IC₅₀ для пяти линий трансформированных клеток. Из этих данных следует, что бискомплекс ванадила с яблочной кислотой эффективно подавляет рост клеток фибросаркомы (L929), феохромоцитомы (PC12) и трансформированных вирусом клеток почки человека (293). Менее чувствительными к цитотоксическому действию VO(mal)₂ оказались трансформированные вирусом фибробласты мыши (NIH 3Т3). В то же время этот комплекс не проявляет цитотоксичности по отношению к нормальным клеткам (табл.1).

Известно, что соединения ванадия могут осуществлять антипролиферативное и цитотоксическое действие путем ингибирования синтеза ДНК (14), а также взаимодействия ДНК с факторами транскрипции (15).

Включение радиоактивного предшественника в ДНК.

Для исследования пролиферации клетки синхронизовали в ростовой среде, содержащей 0,5% эмбриональной телячьей сыворотки в течение 24 часов, затем добавляли исследуемые соединения и С¹⁴-тимидин. Через 24 часа после этого клетки промывали холодным раствором Хэнкса и обрабатывали в течение ночи ледяным фиксирующим раствором для того, чтобы убрать из клеток свободный радиоактивный предшественник синтеза ДНК. Затем измеряли число клеток после их окраски кристаллвиолетом, используя мультискан “LabSystems”. Клеточный монослой лизировали в течение 12-ти часов 0.6 н. КОН, затем лизат нейтрализовали 1н. HClO₄. Радиоактивность измеряли стандартными радиометрическими методами, используя сцинтилляционную жидкость Брея. Результаты рассчитывали в имп./мин на 10⁶ клеток и в % к контролю.

Результаты исследования по влиянию VO(mal)₂ и VOSO₄ на включение С¹⁴-тимидина в ДНК свидетельствуют о том, что синтез ДНК в клетках L929 менее чувствителен к действию оксованадиевых соединений по сравнению с клетками PC12 и его подавление наблюдается только при высоких концентрациях (табл.6). Отметим, что в клетках HepG2, которые оказались на порядок менее чувствительными к цитотоксическому действию оксованадиевых соединений, чем другие линии трансформированных клеток (см. табл.7), ингибирования синтеза ДНК в этих условиях мы не наблюдали.

ЛИТЕРАТУРА

1. Badmaev V., Prakash S. and Majeed M. (1999) J. Alternat. Complement. Medicine, 5, 273-291.

2. Evangelou A.M. (2002) Crit. Rev. Oncol./Hematol., 42, 249-265.

3. U.S. Pat. 5,877,210, 02/03/1999.

4. Bishayee A., Oinam S., Basu M. and Chatterjiee M. (2000). Brain Cancer Res. Treatment, 63, 133-145.

5. Osinska-Krolicka I., Podsiadly H., Bukietynska K. et al (2004). J. Inorg. Biochem., 98, 2087-2998.

6. Thompson H.J., Chasteen N.D. and Meeker L.D. (1984). Carcinogenes, 5, 849-851.

7. Liasko R., Kabanos T. A., Karkabounas S. et al (1998). Antycancer Res., 18, 3609-3613.

8. Kopf-Maler P. (1994) Eur. J. Clin. Pharmacol., 47, 1-16.

9. Cruz O. J D., Uckun F.M. (2002). Expert Opin. Investig. Drugs, 11, 1829-1836.

10. Ray R.S., Rana В., Swami В. et al (2006) Chem. Biolog. Interact, 163, 239-247.

11. Ray R.S., Roy S, Ghosh S. et al (2004). Biochim. Biophys. Acta, 1675, 165-73.

12. Naria R.K, Chen C.L., Dong Y, Uckun F.M. (2001). Clin. Cancer Res., 7, 2124-33.

13. Патент РФ 2101287, 1998.

14. Hall I.H., Durham R.W, Tram M. et al. (2003). J Inorg. Biochem, 93, 125-131.

15. Lampronty I., Bianchi N., Borgatty M. et al. (2005). Oncol. Rep., 14, 9-15.

Таблица 6 Действие VO(mal)2 и VOSO4 на синтез ДНК в клетках L929 и РС12
Концентрация соединения (мкг/мл)	Включение 14С тимидина в ДНК (% от контроля)
Клетки PC12	Клетки L929
Время инкубации (часы)	Время инкубации (часы)
VO(mal)2	VOSO4	VO(mal)2	VOSO4
72	96	72	96	72	96	72	96
0	100±1	100±1	100±1	100±1	100±1		100±1	–
3,0	88±8	59±5	96±8	90±8	–	–		–
6,0	70±7	34±3	66±7	58±6	–	–	–	–
12,0	–	–	–	–	76±6	–	104±7	–
24,0	–	–	–	–	68±6	–	63±5	–

Таблица 7 Цитотоксическая активность VO(mal)2 и VOSO4 по отношению к различным линиям трансформированных клеток
IC50 (мкМ)
Клетки	Ванадильные соединения
	VO(mal)2	VOSO4
48 час	72 час	48 час	72 час
PC12	13,5	3,2	15,8	3,9
L929	18,0	4,2	15,0	5,1
293	18,1	–	–	–
NIH 3Т3	37,5	12,9	35,6	13,4
HepG2	–	45,0	–	83,0

Формула изобретения

Средство, проявляющее противоопухолевую активность, представляющее собой бис(L-малато)оксованадий (IV).