Патент на изобретение №2376012

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОГО ЛИПОСОМАЛЬНОГО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний. Основу способа составляет: растворение навесок липидов и рифампицина в хлороформе, приготовление раствора гентамицина сульфата, создание эмульсии из хлороформенного раствора липидов с рифампицином, получение липосом выпариванием с обращением фаз, удаление невключившихся в мембрану рифампицина и внутрь везикул гентамицина сульфата центрифугированием, отличающийся тем, что при получении липосом добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле», это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере исключает токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на мембрану липосом и антибактериальные препараты, сокращает время обработки. 1 ил.

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к проблеме создания новых липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний.

Проблемы, связанные с непосредственным использованием лекарств в фармакологии и медицине, могут быть разрешены путем использования систем переносчиков (Макаров К.А., Кибардин С.А. Иммобилизованные биопрепараты в медицине. – М.: Медицина. – 1980. – 128 С.).

8. – С.47-50).

6. – С.79-82). Антибиотик в основном концентрируется в паренхиматозных органах (печени, селезенке), легких и, кроме того, доставка препарата путем эндоцитоза непосредственно в лизосомы уменьшает его инактивацию и позволяет оптимизировать антимикробное действие. Это приобретает особо важное значение для лечения и профилактики таких инфекций, как сап и мелиоидоз, возбудители которых находятся внутри фиксированных макрофагов.

Вместе с тем проблема экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекционных заболеваний разработана недостаточно.

5. – P.385-397).

Приготовление мелких моноламеллярных липосом методом ультразвуковой обработкой: взвесь липосом, полученную по методу, описанному выше, переносят в сосуд для ультразвуковой обработки и производят озвучивание в атмосфере азота. Режим озвучивания: частота – 20 кГц; мощность – 200 Вт; экспозиция – 30 мин. Для предотвращения разогрева взвеси липосом применяют ледяную баню. В процессе озвучивания происходит просветление взвеси липосом. По окончанию обработки препарат представляет собой прозрачную жидкость, опалесцирующую при боковом освещении. Образуются очень мелкие, однородные по размеру 20-200 Å моноламеллярные липосомы. Включение материала не превышает 1,5%. Данным способом можно включать низкомолекулярные вещества, устойчивые к ультразвуку. В основном он применяется в биофизических исследованиях мембран (Papahadjopoulos D., Wotkins J.C. Phospholipid model membrynes. II. Permeabilyti properties of hydrated liguid crystals. – Biochim. et biophys. Acta, 1967, vol. 135, p.639-652).

³. 1 мл раствора включаемого материала (гентамицина сульфат – 28,5 мг) в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 добавляют к раствору липидов в органической фазе и обработкой ультразвуком 20 кГц, мощностью 200 Вт в течение 5 минут достигают образования эмульсии типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяют к роторному испарителю, и постепенно понижая давление так, чтобы не происходило кипение, полностью удаляют органический растворитель. Об окончании выпаривания судят по образованию геля в колбе и исчезновению запаха органического растворителя. В процессе выпаривания поддерживают температуру смеси выше температуры фазового перехода фосфолипидов (20-25°С). Колбу снимают с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5 и встряхивают до образования гомогенной суспензии липосом. Липосомы, полученные данным методом, характеризуются высокой эффективностью включения – до 50-60% и большими размерами – до 1,0-1,2 мкм. Невключившийся материал удаляют центрифугированием. Недостатком является малая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле», вследствие чего в каждом конкретном случае требуется подбор состава липидной смеси, техники выпаривания и навыка в работе, использование смеси растворителей с разной температурой кипения, что приводит к неоднородному образованию фосфолипидных везикул (температура кипения эфира +34,5°С, температура кипения хлороформа +61,2°С), а также токсическое воздействие ионов титана на антигенный материал и фосфолипиды (Г. Грегориадис, А. Аллисон. Липосомы в биологических системах. – М.: Медицина. – 1983. – С.28-29).

Целью изобретения является получение комбинированного липосомального антибактериального препарата, содержащего в мембране водонерастворимый рифампицин, во внутреннем объеме – гентамицина сульфат.

Поставленная цель достигается тем, что вследствие увеличения липидной нагрузки происходит встраивание рифампицина в мембрану липосом, повышается ее стабильность и возрастает процент инкапсуляции гентамицина сульфата. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на антибактериальные препараты и фосфолипиды. Для этого 63,3-50,1 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 4,3-3,8 мл хлороформа и смешивали с 1,0-0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6,0-3,0 мг антибиотика. 28,5-7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Отделение невключившихся антибиотиков проводили центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч на центрифуге «Ja-21» «Bechman» (США). В супернатанте определяли радиоизотопным методом по двум меткам ¹²⁵I-рифампицин и ¹⁴С-гентамицина сульфат.

Увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки.

Добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки. Данный способ позволяет встроить в мембрану 50% рифампицина и инкапсулировать внутрь липосом 70% гентамицина сульфата.

Примеры конкретного выполнения:

Пример 1. Получение липосом с высоким содержанием в мембране рифампицина и внутри везикул гентамицина сульфата

Предлагаемая дозировка может найти применение для создания максимальных концентраций антибактериальных средств в среде макроорганизма.

Пример 2. Получение липосом с низким содержанием в мембране рифампицина и внутри везикул гентамицина сульфата

Предлагаемые дозы антимикробных препаратов можно использовать в качестве последующего поддерживающего лечения.

Для получения липосом 50,1 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 3,8 мл хлороформа и смешивали с 0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 1,5 мг антибиотика. 7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе. Далее методика приготовления препарата идентична указанной в примере 1.

Таким образом, добавлением к хлороформенной смеси липидов рифампицина в органической фазе и увеличением липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Это позволило встроить в мембрану антибиотик. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на мембрану липосом и антибактериальные препараты и сократить время обработки. Данный способ позволяет встроить в мембрану 50% рифампицина и инкапсулировать внутрь липосом 70% гентамицина сульфата.

Формула изобретения

Способ получения комбинированного липосомального антибактериального препарата, включающий растворение навесок липидов и антибактериального препарата в хлороформе, приготовление раствора включаемого препарата, создание эмульсии из органического раствора и растворенного препарата и последующего получения липосом выпариванием с обращением фаз, отличающийся тем, что для получения липосом, содержащих водо- и жирорастворимые антибактериальные средства, увеличивают липидную нагрузку и применяют только один органический растворитель с определенной температурой кипения, для этого 63,3-50,1 мг смеси липидов (фосфатидил-холин, холестерин в соотношении 7:3) растворяют в 4,3-3,8 мл хлороформа и смешивают с 1,0-0,5 мл хлороформенного раствора рифампицина, содержащего 6,0-3,0 мг антибиотика, затем 28,5-7,125 мг гентамицина сульфата, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляют к раствору липидов в органической фазе, и обрабатывают на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 3 мин до достижения образования эмульсии, после чего понижают давление в роторном испарителе и полностью удаляют органический растворитель и к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивают в колбе на роторном испарителе, отделяют невключившиеся антибактериальные средства центрифугированием при 40000 g в течение 1 ч, полученный препарат липосом контролируют по размеру, проценту иммобилизации антибактериального средства и степени окисления липидов мембраны липосом.

РИСУНКИ