Патент на изобретение №2375457

(54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ АТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ О1 И О139 СЕРОГРУПП ОТ ТОКСИГЕННЫХ ПО ГИДРОЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ

(57) Реферат:

Сущность изобретения заключается в том, что атоксигенные штаммы холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп дифференцируют от токсигенных штаммов по наличию гидролазной активности. В качестве субстрата используют глицерин, который вводят в расплавленный агар Мартена из расчета 2,5/100 мл среды с pH 7,8±0,1 и индикатор Нильский голубой сульфат 1,5 мг/100 мл среды, которую разливают в чаши Петри. Подросшие в термостате в течение 4-х часов исследуемые бульонные культуры наносят в объеме 20 мкл на сектора сконструированного агара и проводят в течение 36-48 часов инкубирование посевов при 37°С. По результатам гидролазной активности штаммов проводят их дифференциацию: если на среде выросшие колонии имеют вид нежных полупрозрачных пленок, сливающихся с цветом среды, то исследуемый штамм холерного вибриона является токсигенным и эпидемически значимым. Если колонии представляют собой плотный желтоватый или белесоватый налет, то выросший штамм нетоксигенный гемолитический и не эпидемически значимый. 3 табл.

Предлагаемое изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики гемолитических атоксигенных и негемолитических токсигенных холерных вибрионов.

Актуальной остается на сегодня проблема всестороннего изучения свойств штаммов возбудителя холеры O1 и О139 серогрупп.

Известны работы по изучению различных ферментов возбудителей холеры, в том числе: эстеразы, пептидазы, триацилглицероллипазы, аминокислотные последовательности которых входят в состав белка Hly С (Lip А)-hly – области ответственной за гемолитические свойства штаммов холерных вибрионов.

Однако в этой последовательности присутствуют аминокислотные мотивы и гидролазы, фенотипическое проявление которых не изучено. Множество обнаруженных коротких мотивов гена hly С свидетельствуют в пользу того, что он способен проявлять себя по фенотипу в зависимости от природы и структуры субстратов, находящихся в окружающей среде.

За прототип выбран способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов от токсигенных (см. RU пат. 2257415, C12Q 1/04, C12N 1/20, 27.07.2005 г., БИ 21), заключающийся в том, что в качестве питательной среды используют агар Мартена с pH 9,0 с индикатором – Нильским голубым сульфатом в концентрации 1,0-1,2 мг/100 мл среды и субстратом – эмульгированным куриным жиром в концентрации 1,0-1,5 мл/100 мл, с последующей инкубацией в течение 48 ч при температуре 37°С, а затем по окрашиванию микрогазона дифференцируют атоксигенные штаммы холерных вибрионов, обладающих липазной активностью, от токсигенных, не имеющих окраски микрогазона.

Недостатком известного способа является использование нестандартного субстрата куриного жира, который позволяет выявлять триацилглицероллипазную активность холерных вибрионов, последние включают истинные липазы, являющиеся строго субстратспецифичными ферментами, для которых необходимы стандартные субстраты, а куриный жир не является таковым и требует биохимической характеристики, что усложняет способ дифференциации.

Кроме того, липазная активность в высокой степени подвержена вариабельности в зависимости от физиологического состояния микроорганизма, что усложняет ее выявление.

Задача предлагаемого изобретения состояла в упрощенном способе дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов O1 и О139 серогрупп от токсигенных по гидролазной активности.

Поставленная задача достигается тем, что в способе дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп от токсигенных по гидролазной активности, включающем нанесение исследуемой культуры на питательную среду с индикатором и субстратом с последующим учетом результатов, в качестве субстрата используют глицерин, который вводят в расплавленный агар Мартена из расчета 2,5/100 мл среды с pH 7,8±0,1 и индикатор Нильский голубой сульфат 1,5 мг/100 мл среды, разливают в чаши Петри, после этого подросшие в термостате в течение 4-х часов исследуемые бульонные культуры наносят в объеме 20 мкл на сектора сконструированного агара и проводят в течение 36-48 часов инкубирование посевов при 37°С, затем по результатам гидролазной активности штаммов проводят их дифференциацию, если на среде выросшие колонии имеют вид нежных полупрозрачных пленок, сливающихся с цветом среды, то исследуемый штамм холерного вибриона является токсигенным и эпидемически значимым, а если колонии представляют собой плотный желтоватый или белесоватый налет, то имеем штамм нетоксигенный гемолитический и не эпидемически значимый.

Способ осуществляется следующим образом

Предварительно проводят подготовку исследуемых культур, для этого в 1,0 мл бульона Мартена pH 7,8±0,1 или 1% пептонной воды вносят штаммы холерных вибрионов, при этом минимальная концентрация клеток при посеве составляет 100 микробных клеток. Посевы инкубируют в течение четырех часов в термостате при 37°С.

Проводят конструирование дифференциальной питательной среды: в расплавленный агар Мартена pH 7,8 (±0,1) вводят глицерин – 2,5 мл/100 мл среды и индикатор Нильский голубой сульфат 1,5 мг/100 мл среды. Все манипуляции проводят в асептических условиях во избежание пророста среды.

Агар разливают в стеклянные чашки Петри. После этого подросшие в термостате бульонные культуры в объеме 20 мкл автоматической пипеткой-дозатором наносят на сектора сконструированного агара. Инкубирование посевов проводят в термостате при 37°С в течение 36-48 часов.

В результате глицерин, который добавляют в питательную среду, подвергается гидролизу, причем различными штаммами холерных вибрионов с различной скоростью. При этом глицерин в неэтерифицированном состоянии становится субстратом, направленный гидролиз которого происходит в и положениях.

Таким образом, гидролазную активность холерных вибрионов рассматривают как дифференциальный признак.

Учет результатов осуществляют через 36-48 часов. Если на секторах агара культуры выросли в виде непрозрачного плотного микрогазона беловато-желтого цвета, при этом цвет среды не изменяется, то делают вывод о том, что исследуемый штамм гемолитический атоксигенный и не имеет эпидемической значимости. Если на среде выросшие колонии имеют вид голубых полупрозрачных пленок, сливающихся с цветом среды, то исследуемый штамм холерного вибриона является токсигенным, т.е. эпидемически значимым.

Отмечено, что при инкубации посевов в течение 72 часов микрогазоны как гемолитических атоксигенных штаммов (ctx^–Hly⁺), так и негемолитических токсигенных (ctx⁺Hly^–) принимают одинаковый вид: микрогазон токсигенных вариантов уплотняется, приобретает желтоватый оттенок, аналогично гемолитическим штаммам. Это свидетельствует о том, что гидролазная активность специфична для всех холерных вибрионов, однако гемолитические штаммы обладают более выраженной гидролазной активностью, которая проявляется у них через 36-48 часов на среде с глицерином, что позволяет проводить дифференциацию вибрионов внутри вида по данному признаку.

Пример 1

В качестве исследуемых штаммов используют культуры V. cholerae eltor 14863 (ctx^–Hly⁺) и 5879 (ctx⁺Hly^–); V.cholerae O139 «Бенгал» 16077, Р-16131 (ctx⁺Hly^–) и 17918 (ctx^–Hly⁺); V.cholerae classica 569 В и 251 (ctx⁺Hly^–) В качестве субстрата используют глицерин в концентрации 0,5-1,0%. Учет результатов через 48 часов культивирования (см. таблица 1).

Из таблицы 1 видно, что при концентрации в среде 0,5-1,0% глицерина невозможно выявить гидролазную активность микроорганизмов и провести дифференциацию токсигенных негемолитических от нетоксигенных гемолитических вариантов, т.к. концентрации субстрата в среде недостаточно для ее проявления и визуализации. Об этом свидетельствует одинаковый рост всех вариантов холерных вибрионов с образованием голубых полупрозрачных колоний без активного гидролиза глицерина.

Пример 2

В качестве исследуемых штаммов используют культуры V. cholerae eltor 14863 (ctx^–Hly⁺) и 5879 (ctx⁺Hly^–); V.cholerae O139 «Бенгал» 16077, P-16131 (ctx⁺Hly^–) и 17918 (ctx^–Hly⁺); V.cholerae classica 569 В и 251 (ctx⁺Hly^–). В качестве субстрата используют глицерин в концентрации 2,5%. Учет результатов через 48 часов культивирования (см. таблица 2).

Из таблицы 2 видно, что при концентрации в среде 2,5% глицерина наблюдают дифференциацию гемолитических нетоксигенных (ctx^–Hly⁺) и негемолитических токсигенных (ctx⁺Hly^–) вариантов холерных вибрионов по гидролазной активности. При этом гемолитические штаммы эль тор 14863 и O139 серогруппы 17918 вырастают на секторах агара в виде плотного непрозрачного микрогазона беловато-желтого цвета, при этом цвет среды не изменяется. Данные штаммы классифицируются как гемолитические, не имеющие эпидемической значимости. Полученные результаты подтверждают методами определения эпидемической значимости холерных вибрионов, приведенные в МУ 4.21097-02 «Лабораторная диагностика холеры». – М., 2002. – 95 с., а именно в пробе Грейга наблюдается полный гемолиз эритроцитов барана, и результаты ПЦР-диагностики свидетельствуют об отсутствии ctx АВ-гена.

Штаммы токсигенных (ctx⁺Hly^–) вибрионов O1 эльтор 5879, классического биовара 569В, 251, О139 серогруппы 16077, Р-16131, вырастая, образовывают на агаре полупрозрачные голубые, сливающиеся с цветом среды, микрогазоны. При этом активного гидролиза не наблюдалось, что указывает на их токсигенность. В пробе Грейга и в ПЦР эти культуры охарактеризованы как токсигенные негемолитические штаммы.

Таким образом, по характеру роста на среде с 2,5% глицерина штаммов холерных вибрионов можно сделать заключение о гемолитичности и токсигенности штаммов, что определяет их эпидзначимость.

Пример 3

В качестве исследуемых штаммов используют культуры V.cholerae eltor 14863 (ctx^–Hly⁺) и 5879 (ctx⁺Hly^–); V.cholerae O139 «Бенгал» 16077, Р-16131 (ctx⁺Hly^–) и 17918 (ctx^–Hly⁺); V.cholerae classica 569 В и 251 (ctx⁺Hly^–) В качестве субстрата используют глицерин в концентрации 2,5% (см. таблица 3). Учет результатов реакции производили через 36, 48, 72 и 96 часов культивирования на среде.

Из данных таблицы 3 видно, что при культивировании в течение 36 часов гемолитический штамм V.cholerae eltor 14863 (ctx^–Hly⁺) вырастает на агаре в виде плотного непрозрачного микрогазона беловато-желтого цвета, при этом цвет среды не изменяется. Однако гемолитический штамм O139 серогруппы 17918 (ctx^–Hly⁺) не проявил гидролазной активности и образовывал голубые полупрозрачные колонии. Токсигенные варианты вибрионов вырастали в виде полупрозрачных пленок голубого цвета.

При культивировании штаммов в течение 48 часов гемолитические варианты (ctx^–Hly⁺) Ol и O139 серогрупп образовывают микрогазон беловато-желтого цвета, в то время как все токсигенные варианты вибрионов также представляют собой голубые полупрозрачные пленки. Из этих данных можно заключить, что дифференциация токсигенных негемолитических (ctx⁺Hly^–) и нетоксигенных гемолитических (ctx^–Hly⁺) штаммов холерных вибрионов возможна на этапе культивирования штаммов на питательной среде с глицерином в течение 48 часов.

При выращивании штаммов в течение 72 часов на агаре с 2,5% глицерина культуры как нетоксигенных гемолитических, так и токсигенных негемолитических штаммов приобретают плотный белесоватый оттенок и становятся неотличимыми. Культуры штаммов классического биовара сохраняют полупрозрачность. Через 96 часов с момента культивирования все штаммы образуют на секторах агара плотные белесые с восковым налетом колонии. На данном этапе мы видим проявление гидролазной активности всеми штаммами вибрионов, и дифференциация в этом случае невозможна.

Т.о. установлено, что дифференциация холерных вибрионов по гидролазной активности на плотной питательной среде с добавлением глицерина наиболее наглядно проявляется при концентрации субстрата 2,5 мл/100 мл среды и при культивировании штаммов в течение 48 часов при 37°С.

Из проведенных экспериментов сотрудниками Ростовского НИПЧИ установлено, что гидролазную активность холерных вибрионов можно выявить бактериологическим методом на плотной питательной среде с добавлением глицерина в качестве стандартного субстрата в оптимальной концентрации 2,5 мл/100 мл среды. При этом проявляется внутривидовая дифференциация токсигенных негемолитических и нетоксигенных гемолитических штаммов O1 серогруппы биоваров классического и эльтор и вибрионов O139 серогруппы «Бенгал», позволяющая определить эпидемическую значимость исследуемого штамма.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет глицерина в качестве субстрата для выявления гидролазной активности холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы «Бенгал» осуществлять простым способом дифференциацию атоксигенных штаммов O1 и O139 серогрупп от токсигенных.

При этом глицерин является стандартным и доступным органическим соединением, не требующим дополнительной характеристики, производством которого занимаются многие отечественные производители.

Таблица 1
Биовариант серовариант	штамма	Характеристика по ПЦР и пр. Грейга ctx/Hly	Характеристика роста	Определение эпидзначимости
	14863	ctx–Hly+	Рост без активного гидролиза глицерина (образование голубых полупрозрачных колоний)	Гидролизная активность не выявлена, все штаммы сработали одинаково, дифференциация невозможна, эпидзначимость не установлена
V.cholerae eltor	5879	ctx+Hly–	Рост без активного гидролиза глицерина (образование голубых полупрозрачных колоний)
V.cholerae classica	569В	ctx+Hly–	Рост без активного гидролиза глицерина (образование голубых полупрозрачных колоний)
251
	16077		Рост без активного гидролиза глицерина (образование голубых полупрозрачных колоний)
V.cholerae О139 «Бенгал»	Р-16131	ctx+Hly–
17918	ctx–Hly+	Рост без активного гидролиза глицерина (образование голубых полупрозрачных колоний)

Формула изобретения

Способ дифференциации атоксигенных штаммов холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп от токсигенных по ферментативной активности, включающий нанесение исследуемой культуры на питательную среду с индикатором и субстратом, инкубирование посевов при 37°С и дифференциацию штаммов по окрашиванию колоний, отличающийся тем, что дифференциацию проводят по гидролазной активности, в качестве субстрата используют глицерин, который вводят в расплавленный агар Мартена из расчета 2,5/100 мл среды с pH 7,8±0,1 и индикатор Нильский голубой сульфат 1,5 мг/100 мл среды, среду разливают в чашки Петри, после этого подросшие в термостате в течение 4-х ч исследуемые бульонные культуры наносят в объеме 20 мкл на сектора сконструированного агара, инкубирование посевов проводят в течение 36-48 ч и при наличии выросших на среде колоний в виде голубых полупрозрачных пленок, сливающихся с цветом среды, дифференцируют исследуемый штамм как токсигенный и эпидемически значимый, а при наличии колоний в виде плотного желтоватого или белесоватого налета дифференцируют исследуемый штамм как нетоксигенный гемолитический и не эпидемически значимый.