Патент на изобретение №2375455
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МИНИМАЛЬНЫХ КОЛИЧЕСТВ ВИРУСА ГЕПАТИТА А В ВОДНЫХ ОБЪЕКТАХ
(57) Реферат:
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу обнаружения минимальных количеств вируса гепатита А в водных объектах с помощью метода ОТ-ПЦР. Способ обнаружения минимальных количеств вируса гепатита А в водных объектах с помощью метода ОТ-ПЦР осуществляют следующим образом. К исследуемым образцам проб воды добавляют оттитрованный вирус гепатита А из расчета конечного разведения, содержащего подпороговую дозу. Затем в подготовленных предлагаемым способом пробах проводят определение РНК ВГА методом ОТ-ПЦР. Параллельно с опытными исследуют контрольные пробы, представляющие собой суспензию ВГА на дистиллированной воде, содержащей его в пороговой – титр вируса 10-5 и подпороговой – титр вируса 10-6 концентрациях. Оценку результата производят путем сравнения данных, полученных в опыте и контроле. Изобретение позволяет повысить чувствительность метода обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при обнаружении вируса гепатита А в водных концентрациях. 1 ил.
Изобретение относится к области вирусологии, может быть использовано в эпидемиологическом надзоре за гепатитом А и научно-исследовательской работе для обнаружения ВГА. Известны следующие способы определения вируса гепатита А.
Целью изобретения является повышение чувствительности метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при обнаружении вируса гепатита А в водных концентратах. Сущность изобретения и техническое решение заключается в том, что минимальные дозы ВГА, не определяемые с помощью метода ОТ-ПЦР, выявляются на основе «суммарного эффекта» при добавлении в пробы подпороговых доз (ПК×10-1) ВГА с последующей постановкой реакции на наличие РНК вируса. Способ осуществляется следующим образом. Вместо предварительной обработки перед постановкой ОТ-ПЦР к исследуемым образцам проб воды, обращающим на себя внимание с эпидемиологической и (или) санитарно-гигиенической точки зрения, добавляют заранее оттитрованный вирус гепатита А из расчета конечного разведения, содержащего подпороговую дозу (ПК×10-1). Затем в подготовленных предлагаемым способом пробах проводят определение РНК ВГА методом ОТ-ПЦР, руководствуясь инструкцией к тест-системе «Ампли Сене HAV-430» производства ФГУН ЦННИЭ Роспотребнадзора, г.Москва. Параллельно с опытными исследуют контрольные пробы, представляющие собой суспензию ВГА на дистиллированной воде, содержащей его в пороговой (ПК) и подпороговой (ПК×10-1) концентрациях. Оценку результата производят путем сравнения данных, полученных в опыте и контроле. Положительным считается результат, при котором определена РНК ВГА в опытной пробе с использованием подпороговой концентрации вируса (ПК×10-1) в случае отрицательного ответа в соответствующем контроле и положительного ответа при применении пороговой концентрации (ПК). Способ поясняется следующими примерами. 1. В экспериментах с вирусом гепатита А (штамм HAS-15) показано, что методом ОТ-ПЦР (прототипом) удается обнаружить РНК ВГА в концентратах дистиллированной воды, полученных с помощью любого способа концентрирования, содержащий вирус в исходном разведении до 1·10-6 (100%) и 1·10-7 (около 30%). В более высоких разведениях ВГА никогда не определялся. Для реализации предлагаемого способа готовят концентраты из одного литра дистиллированной воды с помощью мембран ММПА+ – 0,2 «Технофильтр» и прибора ПВФ-142 при исходном разведении вируса 1·10-8. В них вносят расчетные количества, заранее оттитрованного ВГА с тем, чтобы в конечном итоге получить разведения его в концентрациях: пороговой (1·10-5) и подпороговых (1·10-6, 1·10-7 и 1·10-8). Затем методом ОТ-ПЦР определяют РНК ВГА. Элекрофореграмма опыта представлена на фиг.1. Положительными оказались пробы за Пробы 2. При исследовании концентрата сточной воды, отобранной с помощью «ловушек» на основе макропористого стекла 5.07.07 г. из 1 канала входного коллектора биологических очистных сооружений г.Балахны Нижегородской области с помощью метода по прототипу был получен «отрицательный» результат. После добавления в этот концентрат вируса (штамм HAS-15) в подпороговой концентрации (1·10-6) с помощью метода ОТ-ПЦР удалось получить положительный эффект. Минимальные количества вируса, содержащиеся в основе (концентрате) и добавке, не выявляемые методом-прототипом в результате эффекта сложения дали положительный результат. В общей сложности было исследовано таких 16 проб сточной воды, отобранных до обработки из входного коллектора различных очистных сооружений с помощью «ловушек» на основе макропористого стекла. Методом-прототипом в 5 из них была обнаружена РНК ВГА. Остальные пробы оказались отрицательными. Дополнительные исследования «негативных» образцов с помощью заявляемого способа выявили еще в 5 из них РНК ВГА. Таким образом, комплексное исследование 16 проб сточной воды, не прошедшей обработку на очистных сооружениях, позволило обнаружить вирус гепатита А в 10 образцах. 3. При исследовании методом ОТ-ПЦР (прототип) ни одна из 18 проб сточной воды, прошедшей обработку на различных биологических очистных сооружениях и отобранной перед выпуском в поверхностные водоемы, не содержала РНК ВГА. Во все эти пробы был внесен вирус гепатита А (шт. HAS-15) в расчете конечного разведения 1-10-6 (подпороговая, не выявляемая с помощью ОТ-ПЦР доза). Повторная постановка метода-прототипа не обнаружила в исследованных пробах РНК ВГА. Таким образом, во всех случаях феномен сложения не осуществился из-за отсутствия вируса в водных концентратах. После очистки сточная вода уже не содержала вирус гепатита А. Способ отработан и опробован в лаборатории эпидемиологии вирусных гепатитов ФГУН НИИЭМ им. акад. И.Н.Блохиной Роспотребнадзора. Предлагаемый способ определения минимальных количеств вируса гепатита А в водных концентратах позволяет повысить чувствительность использованного метода и тем самым увеличить эффективность его при расшифровке скрытых процессов распространения вируса во внешней среде. Чертеж. Результаты опыта по обнаружению вируса гепатита А в водном концентрате, полученном с помощью мембран ММПА+ – 0,2 «Технофильтр» и прибора ПВФ-142. Примечания. 1-4 – основа пробы концентрат суспензии ВГА в разведении 1·10-8 добавка к ней ВГА в разведениях: 1. 1·10-8; 2. 1·10-7; 3. 1·10-6; 4. 1·10-5 5-8 – контроли суспензии ВГА на дистиллированной воде в разведении 5. 1·10-8; 6. 1·10-7; 7. 1·10-6; 8. 1·10-5 9 – отрицательный контроль 10 – положительный контроль
Формула изобретения
Способ обнаружения минимальных количеств вируса гепатита А в водных объектах с помощью метода ОТ-ПЦР, отличающийся тем, что исследуемые образцы проб воды перед постановкой реакции перемешивают с предварительно оттитрованной суспензией вируса гепатита А, взятой в дозе в 10 раз меньшей порогового значения с последующим определением РНК ВГА, метод сопровождают контролями на дистиллированной воде, в которых применяют разведения вируса в пороговой – титр вируса 10-5 и подпороговой – титр вируса 10-6 концентрациях, оценку результатов проводят на основании сравнения показателей индикации РНК вируса гепатита А методом ОТ-ПЦР в исследуемых и контрольных образцах.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||
докт. мед. наук. – М.,1980.- 56 с.]. Для реализации этого метода требуется дорогостоящая аппаратура, специальные лабораторные помещения, оборудованные для работы с радиоизотопами, что ограничивает его применение.
4. – С.50-54]. ОТ-ПЦР обладает самой высокой чувствительностью из всех известных ныне методов детекции ВГА.