Патент на изобретение №2375441
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО ГИДРОЛИЗАТА
(57) Реферат:
Способ получения белкового гидролизата включает ферментативный одностадийный гидролиз биомассы хлебопекарных дрожжей, последующее перемешивание, инкубирование при 45°С, осуществляют контроль и коррекцию рН до 8,3. В качестве ферментного препарата используют панкреатин крупного рогатого скота сухой в количестве 0,14 г на один литр гомогенной суспензии дрожжей. Процесс завершают при достижении значения показателя аминного азота не ниже 2,2%. Полученный гидролизат осветляют при комнатной температуре. Надосадочную жидкость декантируют и проводят консервацию. Способ позволяет получить белковый гидролизат со следующими показателями: общий азот (9,3±2,1)%, аминный азот (2,85±0,б5)%, углеводы (0,04±0,015)%, свободный триптофан (0,107±0,004)% нуклеиновые кислоты (0,002±0,0005)%, витамин B1 (0,000045±0,000003)%, витамин В2 (0,000051±0,000004)%, витамин РР (0,00086±0,00003)%. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при производстве питательных сред для выделения и культивирования микроорганизмов. Известен способ получения белковых гидролизатов из биомассы дрожжей путем аутолиза (см. статью Дятлов И.А. и др. «Разработка препаратора дрожжевого аутолизата – заменителя мясной питательной основы для микробиологических сред», сборник Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран Содружества Независимых Государств, 1998 г., стр.184-186). Однако в виду того, что аутолизат дрожжей – продукт переваривания их без внешних ферментов за счет собственных (пепсиназы, триптазы, эриптазы), последние невозможно дозировать и вносить в гидролизуемую смесь в заданных временных точках. Причем каждый из вышеуказанных ферментов имеет свои оптимум рН и свою специфичность при взаимодействии с белковой молекулой в отношении разрыва пептидных связей. Получаемые в результате такой реакции пептиды имеют различную молекулярную массу, длину и степень полимерности. Эти обстоятельства приводят к тому, что скорость и степень усвоения таких пептидов бактериями достаточно вариабельна, что затрудняет стандартизацию сред на основе аутолизатов. Наиболее близким по технологическому решению является способ получения белковых гидролизатов из биомассы дрожжей (см. авт.св. СССР Недостатком указанного способа является: многоступенчатость процесса гидролиза, необходимость использования в работе сложного оборудования (центрифуг, лиофилизатора), применения малодоступных вследствие их мелкосерийного производства «Протосубтилина Г- 3х», дрожжелитического ферментного препарата Actinomyces cinerosus 3а и кормовых дрожжей Candida guillieroudii – основного субстрата для проведения гидролиза. Эти обстоятельства усложняют способ, а отсутствие примеров использования полученных белковых гидролизатов по известной технологии не дают представления о применении их в качестве питательных сред с широкими технологическими возможностями при культивировании разных микроорганизмов. Техническая задача предполагаемого изобретения состояла в упрощении способа получения белкового гидролизата, используемого в качестве основы для питательных сред при культивировании микроорганизмов. Поставленная задача достигается тем, что в известном способе получения белковых гидролизатов из биомассы дрожжей путем ферментативного гидролиза с последующим инкубированием при 45°С и коррекцией рН 20% раствором гидроокиси натрия, гидролиз проводят в одну стадию, используя в качестве ферментного препарата – панкреатин крупного рогатого скота сухой, который вносят в емкости из расчета 0,14 г на один литр гомогенной суспензии дрожжей, при этом полученную смесь тщательно перемешивают, инкубируют, осуществляют контроль и коррекцию рН до 8,3, а завершают процесс при достижении значения показателя аминного азота не ниже 2,2%, исключая затем дальнейшее его нарастание в течение последующих шести часов, после этого гидролизат осветляют при комнатной температуре, надосадочную жидкость декантируют и проводят консервацию. При этом гомогенную суспензию получают путем измельчения прессованных хлебопекарных дрожжей, которые вносят в прогретые до 45°С емкости и добавляют очищенную подогретую до 45°С воду из расчета (4:1) частей воды к дрожжам с последующим перемешиванием, при этом к полученной суспензии добавляют хлороформ в соотношении (100:1), перемешивают содержимое емкости и устанавливают значение рН 8,3. Кроме того, коррекцию и контроль рН от момента внесения фермента осуществляют в течение первых четырех часов, каждые 20 минут, затем в связи с нарастанием буферной емкости с интервалом один час, а после девятичасового гидролиза с трехчасовым интервалом до окончания процесса. Способ осуществляется следующим образом Прессованные хлебопекарные дрожжи (ГОСТ 171-81) измельчают и вносят их в прогретые до 45°С емкости (например, 20 л), затем туда добавляют очищенную, подогретую до 45°С воду (из расчета 4 части воды на 1 часть дрожжей). После этого емкость закрывают, перемешивают содержимое до получения гомогенной суспензии. В последнюю вносят хлороформ в соотношении 100:1, вновь перемешивают и устанавливают значение рН суспензии равным 8,3 с помощью 20% раствора гидроокиси натрия. Затем проводят гидролиз, в одну стадию для этого в суспензию дрожжей вносят панкреатин крупного рогатого скота сухой (ОСТ 49167-92) из расчета 0,14 г на 1 литр упомянутой суспензии, перемешивают, закрывают емкости крышками и инкубируют при 45°С. При этом, следует отметить, что 0,14 панкреатина является величиной необходимой и достаточной, обоснованной опытными данными. Причем количественное уменьшение фермента замедляет процесс, регистрируя неполный гидролиз белков о чем свидетельствует невысокий показатель аминного азота, а увеличение не дает преимуществ ни в скорости, ни в глубине гидролиза. При этом, в течение первых четырех часов суспензию дрожжей перемешивают с интервалом 20 минут, начиная с пятого часа до окончания гидролиза интервал между перемешиваниями составляет один час. Контроль и коррекцию рН до значения 8,3 осуществляют также 20% раствором гидроокиси натрия каждые 20 минут в течение четырех часов от момента внесения фермента, а затем с интервалом один час вследствие нарастания буферной емкости гидролизуемой суспензии. Начиная с 9 часа и до окончания гидролиза контроль рН и при необходимости его коррекцию осуществляют с трехчасовым интервалом. В процессе переваривания суспензии пекарских дрожжей через каждые два часа проводят определение аминного азота, который является основным критерием гидролиза, (потому как накопление аминокислот и пептидов определяют по количеству аминного азота). Опытным путем было обнаружено, что достаточно определения одного критерия – аминного азота и тенденция роста его подтверждает, что процесс гидролиза идет. В связи с этим в предложенном способе достаточно проводить оптимизацию на аминному азоту для гидролизата, имеющего стандартные показатели. Последние обеспечены стандартным сырьем – хлебопекарскими дрожжами и стандартным ферментным препаратом. Гидролиз считают завершенным, если показатель аминного азота достиг значения не менее 2,2% и в дальнейшем не нарастает в течение шести часов. Ориентировочная длительность гидролиза составляет 15-18 часов. Полученный гидролизат осветляют методом отстаивания при комнатной температуре до формирования плотного осадка. Затем надосадочную жидкость декантируют, разливают в емкости. С целью консервации полученного продукта в емкости с ним добавляют хлороформ из расчета 5 мл/1 л гидролизата, после чего емкости герметизируют и хранят при температуре (2-25)°С, срок хранения 2 года. Физико-химические показатели полученного по предлагаемому способу белкового гидролизата должны быть следующими: рН (8,3±0,2), общий азот (9,3±2,1)%, аминный азот (2,85±0,65) %, содержание хлорида натрия (0,46±0,15)%, углеводы (0,04±0,015)%, свободный триптофан (0,107±0,004)%, нуклеиновые кислоты (0,002±0,0005)%, содержание витамина B1 (0,000045±0,000003)%, содержание витамина В2 (0,000051±0,000004)%, содержание витамина РР (0,00086±0,00003)%. Биологические показатели приготовленного по предлагаемому способу белкового гидролизата определяют путем бактериологического контроля питательных сред для культивирования микроорганизмов на его основе. ПРИМЕР 1. Готовят питательную среду для культивирования и выделения холерного вибриона следующего состава: белкового гидролизата, полученного по предлагаемому способу, – 0,05% (по аминному азоту), NaCl – 0,4%, Na2HPO4 12 Н2О – 0,6%. агара микробиологического – 1,3%, рН (7,8±0,2). Среду стерилизуют при 110°С 20 минут. Приготовленная среда характеризуется следующими биологическими показателями в отношении тест-штаммов холерного вибриона Vibrio cholerae P-1 (145), V.cholerae eitor M -878, V.cholerae non O1/non O139 Р-9741 через 12 часов культивирования при 37°С (см. таблицу 1). Из таблицы видно, что среда приготовления из полученного по предлагаемому способу белкового гидролизата полностью соответствуют требованиям МУ 3.3.2.2124-06 «Медицинские иммунобиологические препараты. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, брецеллеза, легионеллеза». ПРИМЕР 2. Готовят питательную среду для культивирования чумного микроба при 28°С следующего состава: белкового гидролизата, полученного по предлагаемому способу, – 0,08% (по аминному азоту), NaCl – 0,3%, Na2HPO4·12 Н2О – 0,6%, агара микробиологического – 1,4%, рН (7,2±0,1). Среду стерилизуют при 110°С 20 минут. Приготовленная среда характеризуется следующими биологическими показателями в отношении тест-штамма Yersinia pestis EV 1290 через 48 часов культивирования при 28±1°С (см. таблицу 2). Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют, что среда приготовления из полученного по предлагаемому способу белкового гидролизата полностью соответствуют требованиям МУ 3.3.2.2124-06. ПРИМЕР 3. Готовят питательную среду для культивирования сибиреязвенного микроба следующего состава: белкового гидролизата, полученного по предлагаемому способу, – 0,09% (по аминному азоту), NaCl – 0,5%, Na2HPO4·12 Н2О – 0,3%, агара микробиологического – 1,4%, рН (7,2±0,1). Среду стерилизуют при 110°С 20 минут. Приготовленная среда характеризуется следующими биологическими показателями в отношении тест-штамма Bacillus anthracis СТИ – 1 через 21±3 часа культивирования при 35°С (см. таблицу 3). Сравнивая показатели (см. таблицу 3): чувствительности, прорастания, диаметра колоний и их морфологии с требованиями МУ 3.3.2.2124 – 06, приходим к выводу, что они соответствуют этим требованиям. Таким образом, преимущества панкреатического гидролиза пекарских дрожжей – это управляемость и прогнозируемость, возможность дозирования фермента и оптимизации соотношения фермент- субстрат. Мягкость действия панкреатина на белки значительно снижает опасность рацемизации аминокислот и образования вторичных продуктов; узкая специфичность действия трипсина (гидролизует только пептидные связи, образованные основными аминокислотами – лизином и аргинином); достаточно глубокое расщепление им дрожжевых белков с образованием низкомолекулярных пептидов и отдельных аминокислот, хорошо усваиваемых микробными клетками при минимальных затратах энергии на мобилизацию клеточных депептидаз; высокая активность компонентов панкреатина – амилазы и липазы, что значительно снижает концентрацию липидов и полисахаридов в конечном продукте, создает условия для его хорошей осветляемости и возможности использовать в составе сред с индикаторами, сохранение в гидролизате основных нуклеотидов и витаминов группы В, необходимых для стимуляции роста бактерий. Изложенные аргументы в пользу панкреатического переваривания пекарских дрожжей позволили впервые показать, что полученная таким образом питательная основа обеспечивает возможность культивирования и выделения большого круга микроорганизмов, являясь достойной альтернативой традиционным мясным пептонам и триптонам. Использование предлагаемого способа позволяет проводить гидролиз биомассы дрожжей простым способом в одну стадию с использованием одного ферментного препарата – панкреатина крупного рогатого скота сухого, что дает возможность получать основу для питательных сред с широкими технологическими возможностями при культивировании различных микроорганизмов, например холерного вибриона, чумного и сибиреязвенного микробов. При этом в качестве субстрата используются повсеместно доступные, широко применяемые в хлебопекарном производстве, недорогие, стандартизированные прессованные хлебопекарные дрожжи, а фермент – панкреатин крупного рогатого скота сухой выпускается большинством мясоперерабатывающих предприятий, имеет невысокую себестоимость и также стандартизирован в соответствии с требованиями отрасли.
Формула изобретения
1. Способ получения белковых гидролизатов из биомассы дрожжей путем ферментативного гидролиза с последующим инкубированием при 45°С и коррекцией рН раствором гидроокиси натрия, отличающийся тем, что гидролиз проводят в одну стадию, используя в качестве ферментного препарата – панкреатин крупного рогатого скота сухой, который вносят в емкости из расчета 0,14 г на один литр гомогенной суспензии дрожжей, при этом полученную смесь тщательно перемешивают, инкубируют, осуществляют контроль и коррекцию рН до 8,3, а завершают процесс при достижении значения показателя аминного азота не ниже 2,2, после этого гидролизат осветляют при комнатной температуре, надосадочную жидкость декантируют и проводят консервацию. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомогенную суспензию получают путем измельчения прессованных хлебопекарных дрожжей, которые вносят в прогретые до 45°С емкости и добавляют очищенную подогретую до 45°С воду из расчета (4:1) частей воды к дрожжам с последующим перемешиванием, при этом к полученной суспензии добавляют хлороформ в соотношении (100:1), перемешивают содержимое емкости и устанавливают значение рН 8,3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что коррекцию и контроль рН, от момента внесения фермента, осуществляют в течение первых четырех часов каждые 20 минут, затем – с интервалом один час, а после девятичасового гидролиза с трехчасовым интервалом до окончания процесса.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
649745, кл. С12D 13/06, А23J 1/18. 28.02/79. Б8), заключающийся в том, что для получения гидролизата используют последовательно в два этапа ферменты Actinomyces cinerosus 3а и «Протосубтилином Г- 3х» для расщепления клеточных белков и высокомолекулярных полипептидов, а из рода Actinomyces применяют штамм Actinomyces cinerosus 3а.