Патент на изобретение №2374649
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ
(57) Реферат:
Изобретение относится к аналитической химии и может использоваться при мониторинге загрязнений окружающей среды и контроле качества пищевых продуктов. Поставленная задача достигается тем, что тест-система для иммуноферментного определения токсикантов, содержащая колонку, внутри которой размещен тестовый слой в виде иммуноаффинного геля с привитыми специфическими к токсиканту антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами, согласно решению дополнительно содержит контрольный слой в виде иммуноаффинного геля с привитыми специфическими к ферментной метке антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами. Технический результат заключается в упрощении интерпретации результатов анализа без усложнения процедуры пробоподготовки, концентрирования и иммуноферментного определения токсикантов. 1 з.п. ф-лы, 2 ил.
Изобретение относится к аналитической химии и может использоваться при мониторинге загрязнений окружающей среды и контроле качества пищевых продуктов. В современной практике для качественного определения токсикантов различного происхождения широко применяются различные тест-методы анализа. Наиболее распространенными форматами тест-методов являются иммунохроматографические стрипы (С.Paepens, S.De Saeger, L.Sibanda, I.Bama-Vetro, I.Leglise, F.Van Hove, C.Van Peteghem. A flow-through enzyme immunoassay for the screening of fumonisins in maize Analytica Chimica Acta 523 (2004) 229-235; A.Y.Kolosova, S.De Saeger, L.Sibanda, R.Verheijen, C.Van Peteghem. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of zearalenone and deoxynivalenol Anal Bioanal Chem (2007) 389:2103-2107) и иммунофильтрационные тесты (D.Saha, D.Acharya, D.Roy, D.Shrestha, Т.К.Dhar. Simultaneous enzyme immunoassay for the screening of aflatoxin Bl and ochratoxin A in chili samples Analytica Chimica Acta 584 (2007) 343-349). Оба типа тестов основаны на использовании мембран, содержащих тестовую зону, окраска которой зависит от концентрации определяемого вещества в образце, и контрольную зону, окраска которой появляется всегда. Контрольная зона служит для двух целей: 1. На основе сравнения интенсивности окраски тестовой и контрольной полос можно сделать вывод о концентрации определяемого вещества. 2. Развитие окраски контрольной зоны указывает на валидность (работоспособность) теста. Недостатком данных тест-методов является не всегда достаточная чувствительность и необходимость проведения пробоподготовки при использовании интенсивно окрашенных матриц. Известна тест-система для определения токсикантов в виде колонки с детектирующим иммунослоем, который представляет собой иммуноаффинный гель с привитыми специфическими антителами (см. патент ЕР Данная система позволяет существенно повысить чувствительность определения в сравнении с мембранными тестами, однако не содержит контрольной зоны. Недостатком данной системы является отсутствие контрольного слоя, что усложняет интерпретацию результатов и оценку работоспособности теста. Задачей заявляемого изобретения является разработка иммуноферментной тест-системы определения токсикантов в продуктах питания и объектах окружающей среды. Технический результат заключается в упрощении интерпретации результатов анализа без усложнения процедуры пробоподготовки, концентрирования и иммуноферментного определения токсикантов. Поставленная задача достигается тем, что тест-система для иммуноферментного определения токсикантов, содержащая колонку, внутри которой размещен тестовый слой в виде иммуноаффинного геля с привитыми специфическими к токсиканту антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами, согласно решению дополнительно содержит контрольный слой в виде иммуноаффинного геля с привитыми специфическими к ферментной метке антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами. Изобретение поясняется чертежами, на фиг.1 схематически изображена тест-система, на фиг.2 – схема проведения иммуноферментного определения токсиканта, где: 1 – колонка; 2 – пористые фильтры (фриты); 3 – иммуноаффинный гель с привитыми антителами, специфическими к токсикантам; 4 – иммуноаффинный гель с привитыми антителами, специфическими к ферментной метке; 5 – проба; 6 – конъюгат, 7 – промывочный буфер; 8 – субстрат. Тест-система для иммуноферментного определения токсикантов содержит колонку 1, внутри которой размещен тестовый слой в виде иммуноаффинного геля 3 с привитыми специфическими к токсиканту антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами 2, и на расстоянии 1-10 мм контрольный слой в виде иммуноаффинного геля 4 с привитыми специфическими к ферментной метке антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами 2. Тест-система работает следующим образом. Пробу 5 пропускают через колонку 1 сверху вниз, затем вводят конъюгат 6, который представляет собой токсикант или его аналог, ковалентно связанный с ферментом, играющим роль метки. Для удаления излишков конъюгата 6 используется стадия промывки, с помощью промывочного буфера 7. Затем в колонку 1 добавляют субстрат 8, развитие окраски которого катализирует фермент, и наблюдают развитие окраски. В случае появления окраски иммуноаффинного геля 3 с привитыми антителами, специфическими к токсину, результат считают отрицательным образцом, в случае отсутствия окраски – образец положительным. Окраска иммуноаффинного геля 4 с привитыми антителами, специфическими к ферментной метке, должна развиваться в любом случае. Отсутствие окраски указывает на нерабочее состояние тест-системы. Рассмотрим пример конкретного использования предложенной тест-системы для иммуноферментного определения токсикантов на примере определения бензо[а]пирена, пирена и 2,4,6-тринитротолуола в природной и питьевой воде. Для определения токсикантов использовали колонку емкостью 1 мл, в которую помещали детектирующий иммунослой, представляющий собой гель с привитыми специфическими к пирену (для определения бензо[а]пирена или пирена) или к 2,4,6-тринитротолуолу (для определения 2,4,6-тринитротолуола) антителами, и контрольный слой, представляющий собой гель с привитыми специфическими к ферменту антителами. Для работы тест-системы водные образцы не требуют проведения пробоподготовки, т.к. примеси в воде остаются на поверхности верхнего пористого фильтра. Для проведения определения аликвоту (10 мл) анализируемой речной, озерной, питьевой воды, растаявшиего снега пропускали через колонку с тестовым и контрольным слоями с помощью шприца, затем пропускали раствор конъюгата бензо[а]пиренбутановой кислоты с пероксидазой хрена (для определения бензо[а]пирена) или раствор конъюгата пиренбутановой кислоты с пероксидазой хрена (для определения пирена) или раствор конъюгата 2,4,6-тринитробензойной кислоты с пероксидазой хрена (для определения 2,4,6-тринитротолуола). Конъюгат оставляли в колонке на 3-5 минут, затем удаляли промыванием колонки 5-10 мл фосфатно-солевого буфера с добавкой Твин 20. Последним шагом определения являлось добавление в колонку субстрата на основе тетраметилбензидина, после чего в течение нескольких минут наблюдалось развитие синей окраски обоих слоев (при отсутствии токсиканта в пробе). При присутствии токсиканта выше предела обнаружения, тестовый слой остается белым, развивается окраска лишь контрольного слоя. Развитие окраски фиксировали визуально.
Формула изобретения
1. Тест-система для иммуноферментного определения токсикантов, содержащая колонку, внутри которой размещен тестовый слой в виде иммуноаффинного геля с привитыми специфическими к токсиканту антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит контрольный слой в виде иммуноаффинного геля с привитыми специфическими к ферментной метке антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами. 2. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что контрольный слой размещен на расстоянии 1-10 мм от тестового.
РИСУНКИ
|
||||||||||||||||||||||||||
0893690, МПК G01N 33/543K; G01N 33/569F).
