Патент на изобретение №2374320
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP.LACTIS F-119 – ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА LGS И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА LGS С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactococcus lactis subsp.lactis 284 (F-119) депонирован в Коллекции микроорганизмов Московского государственного Университета им. М.В.Ломоносова. Штамм получен слиянием протопластов двух родственных штаммов L.lactis subsp.lactis 729 и 1605 с последующим отбором высокоактивных вариантов на селективных средах и культивированием продуцента в оптимизированной среде. Штамм культивируют в ферментационной солевой среде, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли и дрожжевой автолизат. Получаемая культуральная жидкость обладает антибиотической активностью 6800 МЕ/мл. Ее высушивают с получением антибиотического комплекса LGS, обладающего активностью 1000000-1200000 МЕ/г. При необходимости компоненты антибиотического комплекса разделяют. В выделенном антибиотическом комплексе соотношение антибиотиков LGS-B и LGS-H составляет 1:4. Указанный штамм способен синтезировать антибиотический комплекс с высокой активностью и широким спектром антибактериального действия, эффективного против грамположительных бактерий, включая споровые и патогенные формы, бациллы, листерии, микобактерии, так и против грамотрицательных, таких как бактерии группы кишечной палочки, сальмонеллы, психрофильные бактерии. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, молочной, медицинской и микробиологической, консервной промышленностях, как биоконсервант и как пробиотик, поскольку отвечает всем требованиям, предъявляемым к штаммам данного назначения: высокая ферментативная и антибиотическая активность по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам, обитающим в сырье, продуктах питания и желудочно-кишечном тракте человека и животных. В последние годы наблюдается возросший интерес по использованию бактериоцинов или, как их называют в литературе и повседневной практике, «естественных» антибиотиков, образуемых лактококками, резко возрос. Одним из главных аспектов этого интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для здоровья. Широко используемые химические консерванты и антибиотики, увеличивающие срок хранения продуктов питания, вызывают опасения. Наиболее изученным и разрешенным для применения в качестве биологического консерванта (код Е 234) является бактериоцин низин, единственный из антибиотиков имеющий «GRAS» статус (признанный Европейским парламентом как безопасный). Являясь низкомолекулярным белком, низин легко переваривается с пищей, не оказывает влияния на микрофлору желудочно-кишечного тракта, не токсичен (Eckburg et al., 2005, Bernbom Nete et al., 2006). Обладая способностью адсорбироваться на поверхности спор чувствительных к нему спорообразующих микроорганизмов – основной причины порчи консервов и пресервов, низин нарушает проницаемость мембран, снижает термоустойчивость спор (Лапинска, 1981, Breukink, E., 1999, Cleveland et al., 2001). Особенно возрос интерес к молочнокислым стрептококкам серологической группы N, которые по систематическому положению недавно выделены из группы микроорганизмов рода Streptococcus, включающего патогенные формы, и под новым названием Lactococcus отнесены к категории «Gras», куда относятся микроорганизмы, не вызывающие инфекционных заболеваний человека и животных (Ленглер и др. 2005). Синтез бактериоцинов – наследственная особенность организмов, проявляющаяся в том, что каждый штамм способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ. В настоящее время известны продуценты бактериоцина низина, являющегося по структуре полипептидным антибиотиком, обладающим антибиотической активностью только на грамположительные бактерии. Известен штамм Lactococcus lactis ВКПМ В-7480 (Streptococcus lactis) – продуцент пищевого полипептидного консерванта, который в конце логарифмической фазы роста образует наибольшее количество низина 11500-12500 МЕ/мл и сбраживающий более широкий спектр углеводов и спиртов. RU 2115724 C1, 20.07.1998. Известен штамм Lactococcus lactis ВКПМ B-7699 – способный продуцировать пищевой полипептидный консервант низин. Штамм на производственной среде, использующей фермент мегатерин, за 14-16 ч культивирования образует наибольшее количество низина 12800 МЕ/мл. RU 2151796 С1, 27.06.2000. Известен штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-116 – продуцент антибиотика низина. Штамм является гибридным, полученным при слиянии протопластов низко активных по низину родственных штаммов 729 и 1605, который при культивировании в солевой среде с дрожжевым автолизатом, с содержанием аминного азота 25 мг%, глюкозой, калием фосфорнокислым, магнием сернокислым и хлористым натрием за 8-9,5 ч инкубирования при 25-26°С обеспечивает антибиотическую активность культуральной жидкости на уровне 4000-4200 МЕ/мл, SU 1687616 А1, 30.10.1991. Известен штамм Lactococcus lactis subsp.lactis NRRL-B-18922 – продуцент двух и более низинподобных бактериоцинов. Штамм получен генноинженерным методом переноса плазмид двух штаммов Lactococcus lactis, эффективен против близкородственного штамма Lactobacillus casei 842, с активностью бактериоцинов 1600 МЕ/мл и 400 МЕ/мл с максимумом поглощения при 280 нм и бактериоцином с активностью 3200 МЕ/мл и максимумом поглощения при 230 нм. US 5,348,881, 20.09.1984. Известен антибактериальный белок – лактибиотик, экспрессируемый штаммом Streptococcus salivarius DSM 13084. Антибактериальный белок является бактерицидным в отношении S. pyogenes. Названный «саливарицин В» относится к антибактериальному белку, имеет молекулярную массу примерно 2733 Да по данным ионной масс-спектрометрии и содержит на N-конце аминокислотную последовательность Gly-Gly-Gly-Val-Ile-Gin. Активен в отношении множества видов стрептококков, пригоден в решении проблемы контроля стрептококковых инфекций. RU 2279481 С2, 10.07.2006. Следует отметить, что использование генетически модифицированных бактерий в пищевой промышленности, в медицинской терапии неприемлемо по закону и этическим причинам. В последние годы в генетико-селекционной практике используют метод слияния протопластов, позволяющего соединить полные геномы и цитоплазмы родительских штаммов и часто происходящий в природе при определенных условиях внешней среды. Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является получение без применения мутагенов и генетических манипуляций штамма Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 – продуцента нового антибиотического комплекса, обеспечивающего высокий выход целевого продукта широкого спектра антибиотического действия. Новый штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 – продуцент двухкомпонентного антибиотика, названного авторами LGS, один из компонентов которого – LGS-B эффективен против грамположительных бактерий по типу низина, второй – LGS-H – отнесен к группе алкилароматических кетонов, содержащих также гидроксильные группы, является антибиотиком широкого спектра действия, ингибирует рост грамположительных бактерий, включая споровые и патогенные формы, например, Bacillus cereus, В.coagulans, В.polymyxa, В.mycoides, Clostridium sp., Listeria monocitogenes, Staphylococcus aureus, Mycobacterium sp., Enterococcus sp., а также грамотрицательные бактерии, такие как бактерии группы кишечной палочки (БГКП) – Е. coli, Serratia sp., a также Salmonella gallinarum, S.typhimurium, Proteus vulgaris, Pseudomonas auruginosa, Alcaligenes faecalis. Штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 хранится и депонирован в Коллекции микроорганизмов Московского государственного Университета им. М.В.Ломоносова под коллекционным номером 284. Штамм является гибридным, получен слиянием протопластов двух родственных штаммов L.lactis subsp.lactis 729 и 1605 с последующим отбором высокоактивных вариантов на селективных средах и культивированием продуцента в ферментационной среде, оптимизированной по содержанию фосфатов, углеводному компоненту, с внесением изолейцина и рН-статированием ферментационного процесса. Полученный штамм продуцирует двухкомпонентный антибиотик в 25 раз больше родительских штаммов, в 1,5 раза больше штамма Lactococcus lactis subsp.lactis F-116, взятого за прототип, и обладает редким свойством для бактерий этого рода, а именно – эффективен против широкого спектра патогенных бактерий. Антимикробный спектр действия штаммов в сравнении с низином представлен в таблице 1.
Нуклеотидные последовательности гена 16S рНК депонированы в GenBank под номером EF 100778. Заявляемый штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 имеет следующие характеристики: Морфологические признаки. Грамположительные бактерии, бесспоровые, неподвижные, клетки сферической формы до 2 мкм в диаметре, образующие пары или цепочки до четырех кокков. На агаровых средах образуют более блестящие колонии с ровными краями, мелкие с диаметром до 3 мм, поверхностный рост, глубинный рост на твердых агаровых средах возможен, при этом вырастают колонии лодочкообразной формы. Характер роста на агаровых средах с добавлением гидролизата молока, капустного отвара, дрожжевого автолизата в сочетании с солями или МПА идентичен. Культуральные признаки. При росте в жидких средах, приготовленных на основе гидролизата молока, глюкозо-дрожжевой с солями наблюдается помутнение, в стерильном обезжиренном молоке образуется плотный сгусток. В мясо-пептонном бульоне с 2-4% хлористого натрия наблюдается рост, а с 6,5% хлористого натрия рост отсутствует; в гидролизате молока с рН 9,2 растет, а при рН 9,6 роста нет. Штамм при 45°С не растет, как и при температуре ниже 10°С. Оптимальной температурой инкубирования является 26°С. Физиолого-биохимические признаки. Штамм образует аммиак из аргинина, сбраживает арабинозу, галактозу, маннозу, глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, раффинозу, сорбит, маннит, декстрин. Является типичным представителем гомоферментативного молочно-кислого брожения, при росте образует до 4,0% молочной кислоты, следовые количества диацетила и ацетоина (по креатиновой пробе). За 9,5 ч инкубирования образует два антибиотика – низин с активностью его в культуральной жидкости до 6900 МЕ/мл. Штамм устойчив к низину, фузидиевой кислоте, рифампицину, неомицину, фагоустойчив, не патогенен. Высокая активность штамма стабильна в течение 22 генераций и при длительном хранении в лиофильном состоянии в ампулах с защитной средой, содержащей, мас.%: желатозу – 11,0, сахарозу – 22,0, глютамат натрия – 4,4, цитрат натрия трехзамещенный – 50,0. Штамм можно хранить при 4-6°С в течение месяца в условиях холодильника в виде молочного сгустка. Перевивку производят посредством внесения сгустка с одной микробиологической петли в стерильное обезжиренное молоко (8-10 мл), засеянный инокулят выращивают при 22-25°С в течение 10-12 ч. Влияние различных компонентов ферментационной среды на рост и синтез антибиотического комплекса штаммом Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 приведено в таблице 2.
Высокая антибиотическая активность в культуральной жидкости достигается при культивировании штамма на средах простого состава при возможности замены основного углеводного субстрата (глюкозы или мальтозы на сахарозу). Антибиотическую активность определяли микробиологическим методом с тест -культурой Bacillus coagulans. Среду для культивирования теста готовили на бульоне Хоттингера с добавлением, мас.%: глюкозы – 1,0, NaCl – 0,2, агар-агара – 2,0. Средой для титрования антибиотика низина служила среда, приготовленная на фосфатном буфере с рН 5,5, и добавлением, мас.%: пептона – 2,0, глюкозы – 1,0, агара – 2,0. Ход определения. Культуральную жидкость вместе с биомассой лактококков экстрагировали ацето-уксусной смесью в соотношении ацетон: кислота: вода, как 4:1:6 при 65°С в течение 1 ч. Для этого 0,5 мл культуральной жидкости разводили в 4,5 мл смеси, ставили на экстракцию, полученный экстракт разводили фосфатным буфером в соотношении 1:10 и 0,12 мкл и вносили в лунки на агаровой среде, засеянной тест-культурой. По зонам ингибирования роста теста за 14 ч роста определяли антибиотическую активность экстрактов в пересчете по калибровочной кривой, полученной при титровании растворов стандартного препарата “Nisaplin” фирмы «Aplin @ Barrett, LTD» (Англия), (Стоянова, Егоров, 1999). Установлено, что предлагаемый для патентования штамм Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 – продуцирует антибиотический комплекс LGS, содержащий два антибиотических вещества: 1-й антибиотик, названный LGS-B, имеет в УФ-спектре (С2Н5OН) Молекулярная масса, (М+Н)+, m/z, (MALDI-MS)=506,9; ТСХ (SiO2), Rf=0,75 в системе MeOH-H2O (96:4); – при электрофорезе на бумаге в электролитах с рН 2,4 и 1,1 (550 В, 2 ч) антибиотик остается на старте; ИК-спектр (СНСl3), Обладает активностью в отношении Гр+ и Гр- бактерий и действует на грибы. На основании полученных физико-химических данных антибиотик LGS-B отнесен к группе алкил-ароматических кетонов, содержащих также гидроксильные группы. 2-й антибиотик, названный LGS-H, является аналогом низина (низинподобным бактериоцином); имеет в УФ-спектре (Н2О) Молекулярная масса, (М+Н)+, m/z, (MALDI-MS)=3161.6; ИК-спектр (КВr), ТСХ (SiO2), Rf=0,0 в системе MeOH-H2O (96:4). При электрофорезе на бумаге в электролитах с рН 2,4 и 1,1 (550 В, 2 ч) антибиотик мигрирует к катоду с подвижностью более высокой, чем стандарт низина; – обладает активностью в отношении грамположительных бактерий (по типу низина), включая термостойкую В.coagulans. На основании полученных физико-химических данных антибиотик LGS-H отнесен к группе антибиотиков-полипептидов, обладающих основными свойствами. При разработке способа согласно изобретению было установлено необходимым проводить культивирование штамма L.lactis subsp.lactis F-119 в ферментационной среде, содержащий, мас.%: глюкозу – 1,0, калий фосфорнокислый 1,0, магний сернокислый – 0,02, хлористый натрий – 0,2, изолейцин – 0,01% и дрожжевой автолизат, с содержанием аминного азота 70 мг% – остальное с последующим высушиванием культуральной жидкости, содержащей целевой продукт лиофильной или распылительной сушкой. Полученный антибиотический комплекс LGS, в виде порошка кремового цвета, обладает активностью 1000000-1200000 МЕ/г в пересчете на активность стандартного препарата “Nisaplin” фирмы «Aplin @ Barrett, LTD» (Англия). При необходимости антибиотики LGS-B и LGS-H можно разделить, проводя для этого: отделение биомассы, экстракцию из нативного раствора целевого продукта, содержащего антибиотики LGS-B и LGS-H, и разделение двух антибиотических веществ. Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение. Пример 1. При использовании лиофильно высушенного штамма L. lactis subsp.lactis F-119 последний восстанавливают в стерильном обезжиренном молоке и инкубируют при 26-30°С до образования сгустка. Микробиологической петлей сброженный культурой молочный сгусток вносят в 10 мл стерильного обезжиренного молока и инкубируют 9 ч. Затем тем же способом вносят в посевную промежуточную среду состава, мас.%: глюкоза – 1,0, дрожжевой автолизат, с содержанием аминного азота 35 мг% – остальное. После 9 ч инкубирования 3% инокулята переносят из посевной среды в ферментационную солевую среду, содержащую, маc.%: мальтозу – 1,0; К2НРO4 – 2,0; MgSO4 – 0,02; NaCl-0,2; дрожжевой автолизат, с содержанием аминного азота 35 мг% – остальное. Процесс ферментация ведут 9 ч при комнатной температуре, что обеспечивает антибиотическую активность культуральной жидкости на уровне 4200 МЕ/мл. Пример 2. При использовании лиофильно высушенного штамма L.lactis subsp.lactis F-119 последний восстанавливают в стерильном обезжиренном молоке и инкубируют при 25°С до образования сгустка в ферментационной солевой среде, содержащей, мас.%: глюкозу – 1,0; K2HPO4 – 1,0; MgSO4 – 0,02; NaCl – 0,2; дрожжевой автолизат, с содержанием аминного азота 70 мг% – остальное. Процесс ферментации ведут 9,5 ч при комнатной температуре, что обеспечивает антибиотическую активность культуральной жидкости на уровне 4800 МЕ/мл. Пример 3. Штамм L.lactis subsp.lactis F-119, восстановленный в стерильном обезжиренном молоке, после инкубирования в промежуточной посевной среде состава, как указано в примере Пример 4. Процесс получения антибиотического комплекса LGS ведут аналогично примеру 3, но полученную культуральную жидкость высушивают лиофильной сушкой при температуре замораживания (-40°С), температуре сублимирования – (-30°С), максимальная температура продукта 60°С. Полученный антибиотический комплекс LGS обладает активностью 1000000 МЕ/г в пересчете на активность стандартного препарата “Nisaplin” фирмы «Aplin @ Barrett, LTD» (Англия). Пример 5. При необходимости антибиотики LGS-B и LGS-H разделяют. Для 1 л культуральной жидкости, полученной в результате биосинтеза штамма-продуцента Lactococcus lactis subsp.lactis F-119 с активностью 6800 МЕ/мл, экстрагируют смесью ацетон – уксусная кислота – вода (4:1:5) при 55°С в течение 1,5 ч. После отгона растворителей в вакууме, антибиотик осаждают избытком метанола. Осадок отделяют на стеклянном фильтре, промывают метанолом, затем ацетоном и высушивают в вакууме. Получают около 3,1 г фракции антибиотика LGS-H, содержащего бактериоцин с молекулярной массой, (М+Н)+, m/z, (MALDI-MS)=3161.6 а.е.м., УФ-спектром (Н2O) Из маточного раствора, полученного после осаждения фракции LGS-H, методом экстракции хлороформом с последующей очисткой на колонке с кизельгелем 60 (Merck), получают антибиотик LGS-B с мол. массой, (М+Н)+, m/z, (MALDI-MS)=506,9 а.е.м. и УФ-спектром (С2Н5OН) При ТСХ на пластинках Силуфол (Чехия) в системе MeOH-H2O (96:4) антибиотик LGS-B имеет Rf=0,75, в то время как антибиотик LGS-H имеет Rf=0,0. В выделенном антибиотическом комплексе соотношение антибиотиков LGS-B и LGS-H составляет (1:4). Выход биологически активных компонентов от активности культуральной жидкости штамма-продуцента составляет 65%. Таким образом, свойства заявляемого штамма свидетельствуют о целесообразности его использования как продуцента нового антибиотического комплекса LGS, способного синтезировать антибиотический комплекс на среде простого состава с высокой антибиотической активностью и выходом целевого продукта. Литература 1. Лапинска Е. 1981. Низин и его применение. В кн.: Антибиотики и антибиоз в сельском хозяйстве. М.: “Колос”. С.105-134. 2. Ленглер Й., Древс Г., Шлегель Г. 2005. Современная микробиология. Прокариоты. М.: Мир. Т.2, стр.393.
4. Breukink Eefjan, Ben de Kruijff. 1999. The lantibiotic nisin, a special case or not?, Biochimica et Biophisica acta 1462, 223-234. 7. European Commission, 1996. List of enzymes, micro-organisms and preparations of these in feedingstuffs that are ahhroved in the various Member States. OJ
Формула изобретения
1. Штамм Lactococcus lactis subsp.lactis 284 – Коллекция микроорганизмов Московского государственного Университета им. М.В.Ломоносова – продуцент антибиотического комплекса LGS. 2. Способ получения антибиотического комплекса LGS, характеризующийся тем, что проводят культивирование штамма продуцента по п.1 в ферментационной среде, содержащей источник углерода, калий фосфорнокислый, магний сернокислый, хлористый натрий, изолейцин и дрожжевой автолизат в количестве, обеспечивающем биосинтез с последующим высушиванием культуральной жидкости, содержащей целевой продукт, и при необходимости разделение его на антибиотики LGS-B и LGS-H, при этом антибиотик LGS-B имеет: 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что высушивание проводят распылительной сушкой или лиофильной сушкой.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
mах при 260 нм.
mах, см-1: 3670, 3360, 2850, 1720, 1665, 1450, 1380, 1220-1200, 1120, 1090.
2, высевают в ферментационную солевую среду, содержащую вместо глюкозы сахарозу – 2,0%, добавляют 0, 01% изолейцина (остальные компоненты в том же количестве). Уровень антибиотической активности при тех же режимах составляет 6860 МЕ/мл. Полученную культуральную жидкость высушивают распылительной сушкой при температуре 50-60°С до достижения конечной влажности порошка 2-3%. Полученный антибиотический комплекс LGS, в виде порошка кремового цвета, обладает активностью 1200000 МЕ/г в пересчете на активность стандартного препарата “Nisaplin” фирмы «Aplin @ Barrett, LTD» (Англия).