Патент на изобретение №2373954

(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КРОВЕПАРАЗИТАРНЫХ ИНФЕКЦИЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает забор вирулентной крови и инактивацию последней. При этом забор крови осуществляют от того биологического объекта, которому необходимо приготовить вакцину. Далее кровь предварительно центрифугируют, плазму удаляют, в оставшуюся эритроцитную массу добавляют стерильную дистиллированную воду в соотношении 1:(1,5-2,0), встряхивают в течение 7-12 минут для полного лизиса клеток крови, выдерживают полученный лизат крови в течение 21 дня при температуре 15-25°C, затем вносят в лизат 4% раствор гентамицина и 15% раствор клиндамицина и выдерживают 7 дней. Способ обеспечивает получение эффективной и безопасной вакцины и позволяет существенно снизить затраты на приготовление вакцинного материала. 3 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области гуманитарной и ветеринарной медицины и предназначено для приготовления вакцины для защиты от кровепаразитарных болезней человека, сельскохозяйственных и мелких домашних животных.

Еще в 1934 году Шакалов К.И. применил аутогемотерапию (введение собственной крови подкожно или внутримышечно) при фурункулезе у 29 лошадей и получил хороший результат. Автор производил 1-2- или 3-кратное применение аутогемотерапии с интервалом от 3 до 6 дней. В первый раз больной лошади инъецировали 75-100 мл цитратной крови, во второй и третий – 150-200 мл. Инъекции крови производили подкожно в области подгрудка. В 1936 году Мальцев А.И. применял аутогемотерапию в острых случаях периодического воспаления глаз у лошадей и также получил положительный результат. Азбукин Н.А. и Волков П.К. (1936) применили аутогемотерапию при гнойных эндометритах коров. Остро протекающие гнойные эндометриты при применении аутогемотерапии быстро прекращались. При хронических эндометритах, которые трудно поддаются обычному медикаментозному лечению, аутогемотерапия также показала хороший результат. Оливков Б.М. (1945) изучал аутогемотерапию в хирургической практике. По мнению автора, аутогемотерапия является разновидностью активной или раздражающей терапии. Она представляет собой аутопротеинотерапию, комбинированную с аутосеротерапией и аутовакцинацией (цит. по Шакалов [1]). За рубежом в гуманитарной медицине метод аутогемотерапии используется более 30 лет, схема применения на людях описана Дагмар Ланнингер-Боллинг [2]. По сути, метод аутогемотерапии является базовым прототипом в использовании собственной крови, как вакцинного материала, при внутримышечном или подкожном введении.

Дальнейшие исследования этой проблемы в СССР – опыты по созданию вакцины для овец против бабезиоза, проведенные в лабораторных условиях из вирулентной крови с возбудителем, ослабленным путем хранения при температуре 8-22°С в течение 23-40 дней дали положительный результат. С 1954 года метод активной иммунизации овец против бабезиоза применяли в порядке широкого опыта в Грузии путем прививок кровью от спленэктомированных доноров. Из иммунизированных животных заболело 0,4%, из контрольных – 10,4% овец. В 1960 г. заболеваний не было как среди иммунизированных, так и контрольных животных [3].

Богородицкий [4] использовал в качестве вакцины кровь животных с живыми возбудителями: при бабезиозе и франсаиллезе в период до 3 и 6 месяцев после переболевания, соответственно, и тейлериозе – в период острого проявления. В порядке широкого опыта персоналом племенных совхозов была проведена иммунизация бычков крупного рогатого скота против бабезиоза, тейлериоза и франсаиллеза. Среди 339 иммунизированных животных в живых остались 61,4%, а среди 485 неиммунизированных бычков в живых остались 13,3%. Таким образом, иммунизированных животных сохранилось в 4.6 раза больше, чем неиммунизированных.

Колабский Н.А. [5] использовал в качестве вакцины кровь крупного рогатого скота с анаплазмоидными и кольцевидными формами паразита, которые не переходили в амебовидные или грушевидные формы паразита и, по данным автора, оказались формами, не способными вызвать заражение животного. Всего было иммунизировано 1491 животное, из них заболело 48, или 3.2%, причем 32 из этих 48 заболело на 3-4-й день после иммунизации (возможно, эти животные были в инкубационном периоде). Среди контрольной группы, состоящей из 816 коров, заболело 151 животное, или 18.5%. Приготовление вакцины против бабезиоза для крупного рогатого скота с биологически измененными гемоспоридиями не требует применения лечебных средств. Иммунизированные животные приобретают иммунитет, причем по данным иммунизации 1949 года животные оставались невосприимчивыми в течение 3 лет.

Использование в качестве вакцины суспензии из слюнных желез клещей-переносчиков во всех случаях сопровождалось заболеванием животных бабезиозом (по Степановой Н.И.). Переболевшие бабезиозом животные приобретали нестерильный иммунитет к возбудителю данного заболевания и являлись скрытыми носителями инвазии [3].

Для изготовления вакцины большинством исследователей использовался непостоянный в своих свойствах возбудитель, выделенный от больных или переболевших животных. При введении восприимчивым животным возбудитель массово размножался и без применения химиотерапевтических препаратов вызывал тяжелое переболевание. Кроме того, такой метод приготовления вакцины и иммунизации животных приводил к перезаражению клещей и тем самым создавал дополнительный резервуар возбудителя бабезиоза в природе.

В настоящее время для вакцинации животных за рубежом используют вакцины, приготовленные на основе инактивированных мерозоитов бабезий – Babesia canis [6], Babesia equi [7] и живых аттенуированных штаммов бабезий – Babesia begimina и Babesia bovis [8]. По данным Moreau et аl. [6] иммунизация будет неэффективной, если животное уже инфицировано. Эффективность вакцины для собак “Pirodog” составляет около 88% при условии отсутствия бабезий в крови животных на момент вакцинации.

На настоящий момент способ приготовления вакцины против основных кровепаразитарных инфекций людей не разработан.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу – прототипом является способ приготовления вакцины против кровепаразитарных инфекций по Свирской С.А. [9], включающий забор вирулентной крови от специально подобранных животных-доноров, дефибринизацию крови. Вакцинный материал (дефибринированная кровь) исследовали микроскопически и в отдельных случаях проверяли культурально и биологически для исключения бактериальных загрязнений. Предварительно ставили опыт по проверке длительности инкубационного периода и силы реакции при применении различных доз крови, используемых для вакцинации. Вакцинацию проводили 1 мл вирулентной дефибринированной кровью в комбинации с химиотерапевтическими препаратами (пироплазмином, новоплазмином, акаприном и некоторыми другими антипротозойными препаратами).

Способ прост, но у него есть ряд недостатков. Для вакцинации использовали вирулентную кровь (живых возбудителей) от больных животных-доноров. Внесение в кровь антипротозойных препаратов перед самой вакцинацией не предохраняет животное от последующего заражения, если возбудитель устойчив к препарату или препарат действует на разные формы – только на внеэритроцитарную или только на внутриэритроцитарную форму. В крови животного могут находиться в латентной форме и другие возбудители кровепаразитарных инфекций (бартонеллы, риккетсии, анаплазмы, токсоплазмы и т.д.). Поэтому введение зараженной крови в качестве вакцинного материала в данном случае будет способствовать искусственному распространению инфекции, которая может быть невосприимчивой к используемым антипротозойным препаратам.

Технической задачей изобретения является создание эффективной и безопасной вакцины (аутогемовакцины) против кровепаразитарных инфекций.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Производят забор венозной крови в емкость с антикоагулянтом от того биологического объекта (больное животное или человек), которому необходимо приготовить вакцину. Кровь центрифугируют 10 мин при 5000 об·мин^-1 для осаждения клеток крови с находящейся в них внутриклеточной инфекцией и внеклеточных форм кровепаразитов из плазмы. После центрифугирования супернатант (плазму) удаляют. Отцентрифугированный осадок (эритроцитную массу) лизируют добавлением к последнему стерильной дистиллированной воды в соотношении 1:(1,5-2,0) с последующим тщательным встряхиванием емкости в течение 7-12 мин для полного лизиса клеток крови. Деструктурирование клеток крови и инфекционных агентов происходит за счет вхождения дистиллированной воды в клетки с более высокой концентрацией веществ, клетки разбухают и лопаются. Далее лизат крови выдерживают в течение 21 дня при температуре 15-25°C, производя активное встряхивание емкости в течение 1-3 мин не менее двух раз в неделю. Через 21 день в лизате крови будут находиться элементы дефрагментированных мембран клеток крови, их органелл, гемоглобин, поверхностные мембранные антигены и ДНК возбудителей. Для дополнительной инактивации ДНК и “стерилизации” вакцинного материала в последний вносят 4% раствор гентамицина и 15% раствор клиндамицина и выдерживают еще 7 дней. В частном случае производят забор 5 мл венозной крови в шприц или пробирку с антикоагулянтом, собранную кровь распределяют по 1 мл в 4 пластиковые стерильные пробирки с крышечками объемом 1,5 мл и далее все технологические операции производят одновременно с каждой пробиркой, что позволяет сохранить стерильность вакцинного материала и в последующем дозировать вакцинный материал в определенном объеме.

Полученную аутогемовакцину вводят подкожно или внутримышечно по 3 мл два раза с интервалом между введениями 14 дней или в три приема – по 1.5 мл в 1 и 7 дни и на 14 день – 3 мл. В каждом случае период введения вакцины занимает 2 недели. После применения данной вакцины организм начинает вырабатывать иммунные тела против тех возбудителей, с которыми не смог справиться при длительном паразитоносительстве.

Определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:

1. Забор крови осуществляют от того биологического объекта (больное животное или человек), которому необходимо приготовить аутогемовакцину, что позволяет избежать заражения инфекциями из крови другого организма.

2. Кровь предварительно центрифугируют, преимущественно при 5000 об/мин, что позволяет осадить клетки крови с находящейся в них внутриклеточной инфекцией и внеклеточные формы кровепаразитов из плазмы.

3. После центрифугирования плазму крови с растворенным в ней фибрином удаляют, что позволяет максимально сохранить клетки крови, которые могут содержать возбудителей “кровяных” инфекций, таких как бабезии, малярийный плазмодий, токсоплазмы, бартонеллы, риккетсии, анаплазмы, микоплазмы и т.п.; при этом происходит минимальная контаминация вакцинного материала. В прототипе при дефибринировании крови эритроциты, пораженные “кровяными” инфекциями, а также внеклеточные формы инфекций за счет цитоадгезивных лигандов могли захватываться волокнами фибрина и удаляться из крови.

4. Отцентрифугированный осадок (оставшуюся эритроцитную массу) лизируют добавлением к осадку стерильной дистиллированной воды в соотношении 1: (1,5-2,0) и встряхивают в течение 7-12 минут для полного лизиса клеток крови, что позволяет оставить в лизате ДНК возбудителей “кровяных” инфекций и их поверхностные мембранные антигены.

5. Лизат крови выдерживают в течение 21 дня при температуре 15-25°C, что позволяет выделить ДНК из всех паразитов и освободить ее от белков-гистонов посредством взаимодействии ее с электролитами крови (Na⁺ и К⁺), выделившимися в гемолизат из эритроцитов. Преимущественно два раза в неделю лизат крови активно встряхивают в течение 1-3 минут.

6. К вакцинному материалу добавляют 4% раствор гентамицина и 15% раствор клиндамицина – антибиотиков, обладающих синергизмом и широким спектром антимикробного действия, выдерживают 7 дней для полной инактивации “кровяных” инфекций и стерилизации вакцинного материала.

Принцип аутогемовакцинации построен на том факте, что в крови животных и людей в большинстве случаев содержатся возбудители кровяных инфекций, которые подавляют гуморальный и клеточный иммунитет. Это есть инфекция, которую организм сам уничтожить не может, так как кровепаразиты являются внутриклеточными и хорошо защищены от иммунных клеток организма хозяина и, кроме того, синтезируют вещества, разрушающие гуморальные и макрофагальные антитела.

Использование аутонозода подкожным или внутримышечным введением позволяет восстановить функцию иммунной системы. Особенностью строения внеклеточных форм бабезий является то, что они имеют полисахаридную наружную мембрану, что препятствует работе гуморального и клеточного иммунитета, так как в этой мембране отсутствуют белковые рецепторы. После проникновения в эритроциты полисахаридная мембрана редуцируется и остается одна белковая. Но в этом случае паразит защищен только мембраной эритроцита. Более того, на поверхности пораженных паразитами эритроцитов накапливаются ложные белки-антигены, которые выбрасываются паразитами для избегания иммунного ответа со стороны макроорганизма. При осаждении антигенов центрифугированием и при разрушении эритроцитов в лизат попадают дефрагментированные цитоскелеты клеток эритроцитов и лейкоцитов, органеллы и ДНК клеток белой крови, гемоглобин, поверхностные антигены, расположенные на мембранах эритроцитов, внутриклеточные инфекционные антигены, белки одинарных мембран, ДНК трофозоитов и мерозоитов. Вышедший из эритроцитов белок-гемоглобин в данном вакцинном материале выступает в качестве депонирующего вещества. ДНК, освобожденная от белков-гистонов под действием электролитов крови, становится информативной и доступной для макрофагов, активируя их компетентность. В лизате происходит разбухание и разрушение внеклеточных форм – мерозоитов, которые дополнительно инактивируются антибиотиками (в качестве инактиваторов должны использоваться смеси антибиотиков, ингибирующие 30S и 50S субъединицы рибосом). Срок хранения вакцины – до 1 года при температуре 4-8°С.

Способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Вакцинация проведена на животных – собаках и кошках.

Для приготовления вакцины собаке забирали у животного из вены 5 мл венозной крови в шприц с 50 мкл стандартного раствора гепарина или в пробирку, обработанную ЭДТА. Кровь по 1 мл распределяли в 4 пластиковые стерильные пробирки с крышечками объемом 1.5 мл (эппендорф) и центрифугировали 10 мин при 5000 об·мин^-1, плазму из пробирок удаляли. У кошек в связи с малым объемом крови в организме забирали 1-2 мл крови и распределяли по 0.5-1 мл в 2 пробирки.

В пробирки доливали стерильную дистиллированную воду до объема 0,5-1,0 мл и тщательно встряхивали в течение 7 мин. Затем пробирки выдерживали в течение 21 дня при температуре 15-25°C, два раза в неделю производя активное встряхивание штатива с пробирками в течение 3 мин. Через 21 день в каждую из пробирок вносили по 100 мкл 4% раствора гентамицина и 50 мкл 15% раствора клиндамицина и оставляли пробирки еще на 7 дней.

Полученную вакцину вводили: крупным собакам – подкожно или внутримышечно по 3 мл два раза с интервалом между введениями 14 дней; мелким собакам – в три приема – по 1,5 мл в 1 и 7 дни и на 14 день – 3 мл. В каждом случае период введения вакцины занимал 2 недели. Кошкам вакцину вводили подкожно или внутримышечно в количестве 0,5-1 мл с интервалом в 14 дней.

Всего было вакцинировано 82 животных – 58 собак и 24 кошки. В результате вакцинации было установлено, что при хроническом течении бабезиоза (пироплазмоза) и бартонеллеза с неявно выраженными клиническими признаками заболевания происходило снижение паразитемии на 20-30%, или происходило полное очищение крови. При введении аутогемовакцины в тканях происходит активация клеточного (макрофагального) иммунитета. За счет встречи с антигеном в тканях макрофаги становятся компетентными по отношению к “кровяным” инфекциям и начинают ее уничтожать.

Пример 2.

Пациент А, 42 года. Вакцинирован три года назад. Кровь для приготовления аутогемовакцины предварительно была исследована на наличие кровепаразитарных инфекций. Анализ показал, что паразитемия составляла 68% пораженных эритроцитов.

Для приготовления вакцины произвели забор у пациента 5 мл венозной крови в пробирку с гепарином, кровь по 1 мл распределили в 4 пластиковые стерильные пробирки с крышечками объемом 1.5 мл (эппендорф) и центрифугировали 10 мин при 5000 об·мин^-1, плазму из пробирок удалили. В пробирку долили стерильную дистиллированную воду (вода для инъекций) до объема 1,3 мл и тщательно встряхивали в течение 10 мин. Затем пробирки выдерживали в течение 21 дня при температуре 15-25°C, два раза в неделю производя активное встряхивание штатива с пробирками в течение 1 мин. Через 21 день в каждую из пробирок вносили по 100 мкл 4% раствора гентамицина и 50 мкл 15% раствора клиндамицина и оставляли пробирки еще на 7 дней.

Полученную вакцину ввели пациенту внутримышечно в два приема – по 3 мл в 1 и 14 дни.

Через 4 месяца после вакцинации паразитемия у пациента снизилась до 1-2% и сохранялась стабильной в течение 3 лет.

Всего заявляемой вакциной было вакцинировано 95 человек.

Заявляемый способ обеспечивает получение эффективной и безопасной вакцины и позволяет существенно снизить затраты времени и финансовых средств на приготовление вакцинного материала. Применение аутогемовакцины устраняет возможность развития аллергических реакций, которые могут возникнуть на введение вакцины из экзогенного антигена. Приготовление вакцинного материала возможно в лабораторных условиях поликлиник и стационаров, поскольку способ технически прост, эффективен и доступен в любой лаборатории. Использование заявляемой вакцины позволит улучшить иммунобиологическую реактивность организма и усилить активную иммунизацию против “кровяных” внутриклеточных инфекций. Данная вакцина особенно рекомендована тем пациентам, которые по каким-либо причинам не могут принимать антипротозойные препараты и антибиотики.

Источники информации

1. Шакалов К.И. Патогенетическая терапия заболеваний животных. – Л. – М.: Сельхозгиз, 1961, – 496 с.

2. Ланнингер-Боллинг Д. Целительная сила крови: руководство по аутогемотерапии. Пер. с нем. – М.: Арнебия. 2001, – 140 с.

3. Болезни овец (Под ред. Терентьева Ф.А., Маркова А.А., Полыковского М.Д. – М.: Сельхозиздат; 1963. – 520 с.

1. – Р.19-33.

1-3. – P.231-236.

Формула изобретения

1. Способ приготовления вакцины против кровепаразитарных инфекций, включающий забор вирулентной крови и инактивацию последней, отличающийся тем, что забор крови осуществляют от того биологического объекта, которому необходимо приготовить вакцину, далее кровь предварительно центрифугируют, плазму удаляют, в оставшуюся эритроцитную массу добавляют стерильную дистиллированную воду в соотношении 1:(1,5-2,0), встряхивают в течение 7-12 мин для полного лизиса клеток крови, выдерживают полученный лизат крови в течение 21 дня при температуре 15-25°, затем вносят в лизат 4%-ный раствор гентамицина и 15%-ный раствор клиндамицина и выдерживают 7 дней.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что собирают 5 мл венозной крови в шприц или пробирку с антикоагулянтом, а затем собранную кровь распределяют по 1 мл в 4 пластиковые стерильные пробирки с крышечками объемом 1,5 мл.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что кровь центрифугируют при 5000 об/мин^-1 в течение 10 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при выдерживании лизата крови последний интенсивно встряхивают в течение 1 -3 мин не менее двух раз в неделю.