Патент на изобретение №2373941
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ВОЗРАСТНЫХ И ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ КОЖНЫХ ПОКРОВОВ ЧЕЛОВЕКА
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может использоваться для лечения или омоложения кожи человека. Для этого в область лечения или омоложения кожи вводят суспензию аутогенных фибробластов в физиологическом растворе и гиалуроновой кислоты. При этом кожный покров предварительно обрабатывают ростовой средой фибробластов с биологически активными веществами (БАВ) – факторами ростовой среды, включающими в т.ч. факторы роста фибробластов, в виде геля. Способ обеспечивает разглаживание морщин, повышение эластичности и упругости кожи. 5 з.п. ф-лы,2 табл.
Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии и клеточной терапии, способам омоложения и лечения кожи человека. Способ включает введение в область лечения или омоложения тканей или органов суспензии аутогенных (того же организма) фибробластов в физиологическом растворе с добавлением гиалуроновой кислоты. Кроме того, предлагается стимулировать пролиферативную и синтетическую активность вводимых фибробластов с помощью продуктов роста фибробластов, содержащихся в среде, которая используется для их роста. Для этого предлагается выделять эти факторы из среды и использовать их в качестве составляющих в косметическом средстве, которое затем можно использовать перед клеточной терапией для подготовки кожи, а также после терапии – для увеличения эффекта методики и его пролонгирования. В настоящее время клеточная терапия осуществляется следующим образом. Шприцем вводят клетки в место, требующее коррекции, и затем ожидают результата. При этом используют как аутогенные, так и аллогенные клетки (Патент США 5660850 26.08.1997; Boss W.K. Jr, Usal H, Fodor P.B, Chemoff G. Autologous cultured fibroblasts: a protein repair system. Ann Plast Surg. 2000 May 44(55): 536-542). Аналогичное описание методики приводится в другом патенте (Патент Несмотря на все более широкое распространение метода, все же остается открытым вопрос об эффективности применения аутогенных клеток для клеточной терапии, особенно у взрослых и пожилых людей (Крехели Э.А, Згурский А.А., Терехов С.М. Применение аутогенных фибробластов в косметологии. Эстетическая медицина. 2004. Т.3. Предлагаемая методика позволяет значительно повысить выживаемость клеток и увеличить эффективность клеточной терапии. Гиалуроновая кислота действует как наполнитель кожного матрикса, создавая жизненный объем для вводимых аутогенных клеток, увеличивает время сохранения клеток до введения их в область терапии и способствует лучшей приживаемости клеток после их введения. Ввод растворов препаратов осуществляется с помощью шприца в область терапии. Концентрация препаратов и время их действия подбирается индивидуально в соответствии с конкретными условиями и в зависимости от возраста пациента, физического состояния, конкретного органа и ткани. 5 фибробластов, суспендированных в 200 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в сочетании с 200 мкл Рестилайна, масса образующихся узелков несколько уменьшалась в течение первых 2 недель и далее не изменялась до 16 недель. Контрольные узелки, образовавшиеся после введения Рестилайна, разбавленного ФСБ, уменьшались за время наблюдений в 2 раза. Иммунохимическое окрашивание показало присутствие человеческого коллагена в узелках опытной группы по сравнению с контрольной группой. Полученные результаты указывают, что Рестилайн, смешанный с культивируемыми фибробластами кожи человека, может быть успешно инъецирован как живой трансплантат с возможностью долговременного эффекта. Нами проведены исследования, в которых фибробласты кожи людей вводились в проблемные места кожи пациента в физиологическом растворе и также вместе с гиалуроновой кислотой. Соотношение было следующим. Брали 0,5 мл суспенции фибробластов с 1 млн. клеток в физиологическом растворе и туда добавляли 0,5 мл гуалуроновой кислоты. Получали 0,5 млн кл./мл раствора. Исходный раствор гиалуроновой кислоты был в пределах 0,02-0,1%, чтобы конечная концентрация в суспензии составляла 0,01-0,05%. Суспензию перемешивали и проводили обкалывание шприцом проблемных мест. Результаты были следующими. Папулы инъекций фибробластов с гиалуроновой кислотой держатся в 2 раза дольше, чем без него. Это значит, инъецированные фибробласты имеют больше возможностей для выживания и выполнения заложенных в них функций – продукции коллагена и эластина, что естественно ведет к разглаживанию морщин и фактически видимому уменьшению их глубины, размягчению кожи, повышению ее эластичности и упругости. Визуально это наблюдается по уменьшению заметности морщин, сглаживанию складок, выравниванию рельефа кожи. Скорость уменьшения защипов увеличивается как минимум в 1,5 раза, что говорит о реальном омоложении кожи также в эквивалентной величине. Полученные результаты указывают, что гиалуроновая кислота, смешанная с культивируемыми фибробластами кожи человека, может быть успешно инъецирована как живой трансплантат с возможностью долговременного эффекта. Второе предложение состоит в том, чтобы стимулировать пролиферативную и синтетическую активность вводимых фибробластов. Для этого предлагается использовать продукты роста фибробластов, содержащиеся в среде, которая используется для их роста. Обычно в косметическом средстве применяются вещества растительного происхождения или синтезированные химически, применяют также гиалуроновую кислоту (Патент РФ При культивировании в ростовой среде фибробласты кожи синтезируют и выделяют в окружающую среду большое количество биологически активных веществ, среди которых можно выделить различные факторы роста (EGF, FGF, TGF, KGF), компоненты внеклеточного матрикса (ГАГ, ГК, хондроитин сульфат) и ферменты (EGF – фактор роста эпидермиса, регулирует миграцию и пролиферацию эпидермальных клеток кожи. FGF – фактор роста фибробластов, стимулирует рост всех типов клеток и продукцию внеклеточного матрикса, TGF – транформирующий фактор роста, участвует в образовании новых кровеносных сосудов; KGF – фактор роста кератиноцитов (Крихели Э.А., Згурский А.А., Терехов С.М. Применение аутогенных фибробластов в косметологии. Эстетическая медицина. 2004. Т.3. Авторы пришли к выводу, что эту среду можно использовать для приготовления косметического средства, которое можно будет применять как до, так и после применения клеточной терапии. При этом, такое косметическое средство можно смело назвать индивидуальным (личным), т.к. используются факторы, исходно принадлежащие реципиенту. Присутствие в коже ростовых факторов и других перечисленных веществ от собственных клеток будет способствовать улучшению ее состояния, обеспечению выживаемости имеющихся и привнесенных извне, в результате клеточной терапии, клеток. На основе данных факторов предлагается изготавливать индивидуальную косметику под общим названием: медицинское индивидуальное косметическое средство (МИКС). Ее состав может быть следующим. Лиофилизированные факторы роста и белковые ингредиенты ростовой среды, в которой росли аутогенные фибробласты пациента, глицерин, в качестве наполнителя, гиалуроновая кислота для создания матрикса в дерме, ароматические компоненты для придания привлекательного запаха. Предлагаются следующие рецептуры. 1. Клетки выращиваются 14-28 дней на среде, содержащей сыворотку, и на бессывороточной среде. Рецептура приготовления геля, вариант 1:
Рецептура приготовления геля, вариант 2:
2. Биологически активные вещества, продуцируемые клетками в среду, концентрируются с использованием методик “Minhan”, “Pillicon” -“Millipore” USA либо подвергаются лиофилизации. Содержание всех биологически активных веществ (БАВ), включая витамины и аминокислоты ростовой среды, факторы роста и др., составляет порядка 10 мг/мл в ростовой среде. Рецептура приготовления геля, вариант 3:
Срок хранения 50-60 дней при +4°С. Курс применения 10 ампул по 2 мл в течение 20 дней через день. Через 5-7 дней второй курс снова по 10 ампул через день – минимальный курс. Курсы можно применять как до, так и после клеточной терапии. Косметика применяется следующим образом. Вскрывается 1 ампула и ее объем наносится вечером на проблемные места. После этого препарат не смывается до следующего утра. Через день на следующую ночь используется вторая ампула. В последующие дни аналогично используется 3-я и затем другие ампулы до 10. После клеточной терапии через 10 дней также используются другие 10 ампулы. Через 5-7 дней второй курс снова по 10 ампул через день. Таким образом, имеются следующие варианты применения индивидуальной клеточной косметики: 1) 1 курс до клеточной терапии; 2) 2 курса после клеточной терапии; 3) 2 курса до и 2 курса после клеточной терапии. Естественно, остается возможность применения клеточной технологии без использования МИКС. МИКС является косметическим средством наружного применения. Благодаря этим факторам и после их внесения на кожу, межклеточное вещество будет постепенно обновляться и, значит, омолаживаться. Это также создает благоприятные условия для приживления аутогенных фибробластов и их лучшего функционирования в дальнейшем. Были проведены испытания на добровольцах. Результаты испытаний описаны ниже, а также в таблице 1 и подтверждают промышленную применимость способа.
Доброволец Б. O.K. 53 г., пол женский [Контроль]. При осмотре кожи лица обнаружено: снижение тургора кожи в области щек, подбородка; глубокие морщины в области носогубных складок, на переносице, лбу, вокруг глаз; обезвоживание и изменение контура лица. Диагноз: возрастные изменения кожи лица. Коррекция проблемных зон кожи лица была проведена заявленным способом с использованием аутогенных клеток и гиалуроновой кислоты. Назначение: пересадка аутологичных фибробластов в проблемные зоны кожи лица совместно с гиалуроновой кислотой. Для этого у добровольца брали кусочек кожи с внутренней поверхности предплечья. Биопсию (диаметром 4 мм) после промывки (2 раза) в растворе питательной среды ДМЕМ с антибиотиками пенициллин (50 мкг/мл) и стрептомицин (50 ед/мл) помещали в чашку Петри и измельчали скальпелем в 0,1 мл 0,25% раствора коллагеназы II типа. После измельчения кусочки ткани закрывали покровным стеклом и в чашку заливали 2 мл того же раствора коллагеназы. Чашку Петри ставили в СО2-инкубатор. Через 1,5 ч чашку вынимали, раствор коллагеназы выливали, промывали средой ДМЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и вновь заливали ростовую среду. Через 1 сутки среду меняли на свежую. Через 5 суток кусочки кожи смывали, среду с кусочками кожи помещали в центрифужную пробирку, центрифугировали 3 мин при 1000 об/мин, надосадок выливали, осадок помещали в новую чашку Петри, закрывали покровным стеклом, заливали среду ДМЕМ с 20% ЭТС и ставили в С02-инкубатор. Периодически через 3 суток среду меняли на свежую. Через 15 суток после достижения монослоя кусочки кожи со средой помещали в центрифужную пробирку и выполняли аналогичные действия. Затем в чашку Петри 2 раза споласкивали клетки раствором ЭДТА, после чего заливали 1 мл раствора трипсина. Чашку Петри помещали в СО2-инкубатор. Через 15 мин когда клетки откреплялись от ростовой поверхности в чашу залили 2 мл ростовой среды, клетки суспендировали и перенесли в культуральный флакон площадью 75 см2 и добавили 10 мл ростовой среды с 20% ЭТС, флакон поместили в СО2-инкубатор. Через 7 суток после достижения монослоя клетки сняли с поверхности роста аналогичным образом и перенесли клетки во флакон площадью 150 см2. В течение месяца клетки пересевали аналогичным образом до достижения монослоя в 10 флаконах площадью 150 см2. Далее клетки 7 флаконов снимали аналогичным образом, суспензию центрифугировали 2 раза в физиологическом растворе и готовили суспензию на физиологическом растворе с концентрацией 2 млн кл/мл и разливали в ампулы по 1,5 мл. После этого производили ввод суспензии в область морщин инсулиновым шприцем. Перед терапией поверхность кожи обрабатывали 70% раствором этилового спирта или 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводили местную анестезию 5% кремом Эмла. Ввод суспензии производили в поверхностный или средний слой дермы по 0,05 мл с интервалом 5-6 или 8-10 мм в зависимости от рода морщин. Делали 2 курса с интервалом в 2 недели Вид поверхности кожи фиксировали на фотографиях, а также по визуальным наблюдениям и субъективным оценкам пациента до терапии и после. Доброволец Д.З.К. 55 г., пол женский [Опыт]. Имел схожие признаки старения кожи с добровольцем Б. Добровольцу проведены те же действия, что и добровольцу Б. Отличие состояло в том, что ему вводили суспензию аутогенных фибробластов совместно с гиалуроновой кислотой. Для этого аналогичным образом готовили суспензию аутогенных фибробластов на физрастворе в концентрации 2 млн кл/мл и разливали в ампулы по 1,5 мл. После этого непосредственно перед процедурой к суспензии клеток 0,5 мл добавляли 0,5 мл гиалуроновой кислоты (гиалуронат натрия) и производили ввод суспензии в область морщин инсулиновым шприцем. Также делали 2 курса с интервалом в 2 недели Вид поверхности кожи фиксировали на фотографиях, а также по визуальным наблюдениям и субъективным оценкам пациента до терапии и после. Результаты терапии без гиалуроновой кислоты (Доброволец Б. О. К.). Через 4-5 месяцев после пересадки фибробластов наблюдали сглаживание морщин и крупных складок лба; сглаживание морщин на переносице и в латеральной подглазничной области глаз; уменьшилась выраженность и глубина носогубных складок; заметно улучшился тургор кожи, улучшился контур и цвет лица. Результаты терапии с гиалуроновой кислотой (Доброволец Д.З.К.). Через 4-5 месяцев после пересадки фибробластов эффект тот же, что у добровольца Б, однако степень разглаживания морщин выше на 2-3 балла по 10 бальной шкале, степень удовлетворенности пациента выше. Аналогичные результаты получены еще на 10 пациентах, 5 из которых проводили терапию без гиалуроновой кислоты, а 5 с гиалуроновой кислотой. Подбирали пары добровольцев таким образом, чтобы их параметры были примерно одинаковыми. Также были проведены испытания на добровольцах индивидуальной косметики МИКС. Результаты описаны ниже и сведены в таблицу 2. Добровольцам проведены те же действия, что описаны выше, т.е. таким же образом получали культуры аутогенных клеток и также готовили суспензии клеток. Отличие состояло в том, что части добровольцев вводили только суспензию фибробластов, а другим проводили, кроме курса клеточной терапии, курсы собственной косметики как до, так и после применения клеточной терапии. Для этого аналогичным образом готовили суспензию аутогенных фибробластов на физрастворе в концентрации 2 млн кл/мл и разливали в ампулы по 1,5 мл. После этого производили ввод суспензии в область морщин инсулиновым шприцем 2 курсами с интервалом в 2 недели. Вид поверхности кожи фиксировали на фотографиях, а также по визуальным наблюдениям и субъективным оценкам пациента до терапии и после. Части добровольцев делали обработку кожи индивидуальной косметикой МИКС до клеточной терапии и после. Для этого готовили индивидуальную косметику, как описано выше. Косметику МИКС применяли по следующей схеме: 1) 1 курс до клеточной терапии (10 ампул через день); 2) 2 курса после клеточной терапии (2 курса по 10 ампул через день).
После применения МИКС наблюдали следующие эффекты по сравнению с контролем. Доброволец А.С., пол мужской, 54 г.: кожа ожила, произошло рассасывание уплотнений, образовавшихся после клеточной терапии, разгладилась кожа, мелкие морщины стали менее заметны. Доброволец Ф.А., пол женский, 40 лет: кожа стала мягче, более упругой, посвежела, морщины разгладились. Добровольцы Ф.О., пол женский, 45 лет, Л.Э., пол женский, 53 г., О.Е., пол мужской, 43 г.: произошли аналогичные изменения. Во всех случаях отсутствовали отрицательные последствия применения МИКС, как объективные, так и субективные. Таким образом, методика показала свою эффективность и отсутствие аллергических и др. негативных реакций.
Формула изобретения
1. Способ омоложения и лечения кожи человека, включающий использование аутогенных фибробластов с добавлением гиалуроновой кислоты, отличающийся тем, что аутогенные фибробласты вводят в область лечения или омоложения кожи в физиологическом растворе, при этом кожный покров предварительно обрабатывают ростовой средой фибробластов с биологически активными веществами (БАВ) – факторами ростовой среды, включающими в т.ч. факторы роста фибробластов. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что готовят 0,5 мл суспензии, содержащей 1 млн фибробластов в физиологическом растворе с добавлением 0,5 мл раствора гиалуроновой кислоты в концентрации 0,02-0,1%, суспензию перемешивают и по 0,1-0,2 мл вводят шприцом в область омоложения или лечения. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ростовую среду в составе геля, в которой содержались фибробласты в течение 14-28 дней на бессывороточной среде, с содержанием БАВ 49%, гиалуроновой кислоты или гиалуроната натрия 0,5-1,5%, глицерина 49,5-48,5%, ароматизатора 0-0,5%. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют ростовую среду в составе геля, в которой содержались фибробласты в течение 14-28 дней с сывороткой, с содержанием БАВ 49%, гиалуроновой кислоты или гиалуроната натрия 0,5-1,5%, глицерина 49,5-48,5%, ароматизатора 0-0,5%. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что факторы ростовой среды перед употреблением концентрируют с использованием известных методик либо подвергают лиофилизации. 6. Способ по 5, отличающийся тем, что факторы ростовой среды добавляют в гель в объеме 0,5-3%, гель также состоит из глицерина 70%, коллагена крупного рогатого скота 1,5%, гиалуроновой кислоты 1,5%, очищенной воды необходимое количество до 100%.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
23.04.2007 [05.06.2009]. ТОФТ К. Сохранность инъецируемых аутологичных человеческих фибробластов. Бюл. эксперим. биологии и медицины, 2000, т. 130,
8, с.203-206. DALLA PAOLA L. et al. Using hyaluronic acid derivatives and cultured autologous fibroblasts and keratinocytes in a lower limb wound in a patient with diabetes: a case report. Ostomy Wound Manage. 2002 Sep; 48(9): 46-9.