Патент на изобретение №2373581

(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АМИЛОИДОЗА У ЖИВОТНЫХ

(57) Реферат:

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной нефрологии, и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных. Для этого старым крысам вводят подкожно через день нативный яичный альбумин из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента. Способ обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных. 2 табл., 4 ил.

Данное изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии и может быть использовано для моделирования экспериментального амилоидоза у животных с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей.

Амилоидоз (амилоидная дистрофия) – нарушение белкового обмена, сопровождающееся образованием и отложением в тканях специфического белково-полисахаридного комплекса – амилоида.

Развитие амилоидоза связано с извращением белково-синтетической функции ретикуло-эндотелиальной системы, накоплением в плазме крови аномальных белков, служащих аутоантигенами. В результате взаимодействия антигена с антителом происходит осаждение грубодисперсных белков, участвующих в образовании амилоида. Откладываясь в тканях (например, в стенках сосудов, железистых и т.п.), амилоид вытесняет функционально специализированные элементы органа.

Амилоид является сложным гликопротеидом, в котором фибриллярные и глобулярные белки тесно связаны с полисахаридами. Амилоид состоит из полипептидных цепей, что определяет двойное лучепреломление при окраске конго красным, свойственное амилоиду. Кроме фибриллярного белка в состав амилоида входит другой белок – так называемый Р-компонент, который одинаков при всех формах амилоидоза.

Установлено, что амилоид содержит альбумины, глобулины, фибриноген, фибрин; среди плазменных белков преобладает

За прототип нами взят способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных (патент РФ на изобретение 2269825, Заалишвили Т.В., Козырев К.М., зарегистрированный 10.02.2006, заявка 2004127649/14 от 15.09.04 г., МПК G09B 23/28), заключающийся в введении белым мышам через день по 1 мл нативного яичного альбумина подкожно в течение 30 дней.

Недостатком прототипа является то, что белые мыши являются мелкими животными, что значительно усложняет исследование функционального состояния различных систем экспериментальных животных. Учитывая, то что у белых мышей объем получаемой крови после декапитации не превышает 1,0 мл, затрудняется ее использование для нужд биохимических и патофизиологических исследований. Также затруднено исследование функционального состояния почек из-за малых физиологических объемов и анатомических размеров.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающего введение белкового препарата подкожно.

Решение этой задачи обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния системы почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных.

Предлагаемый способ отличается от прототипа тем, что для моделирования экспериментального амилоидоза используются старые крысы-самцы (возраст 18-24 мес., масса 350-400 г), которым проводятся подкожные инъекции нативного яичного альбумина из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента с целью получения возможности изучения патогенеза, профилактики и лечения амилоидоза, особенно при исследовании функционального состояния почек, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных. Введение нативного яичного альбумина приводит к развитию системного вторичного амилоидоза с преимущественным поражением почек, селезенки, печени в течение 60 дней эксперимента.

Для получения экспериментального системного амилоидоза проводятся подкожные инъекции нативного яичного альбумина через день из расчета 0,025 мл/г массы тела старых крыс-самцов линии «Вистар» (возраст 18-24 мес., масса тела 350-400 г) в течение 60 дней.

Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у автора сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

Экспериментальным животным (старые крысы-самцы в возрасте 18-24 мес., массой тела 350-400 г) в качестве белкового препарата вводят нативный яичный альбумин через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента, что обеспечивает расширение возможностей моделирования экспериментального амилоидоза у животных, особенно при исследовании функционального состояния почек, системы кровообращения, минерального обмена и других показателей экспериментальных животных, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе моделирования экспериментального амилоидоза у животных, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения экспериментального системного амилоидоза в качестве экспериментальных животных выбраны крысы-самцы линии «Вистар» массой 350-400 г в возрасте 18-24 мес., так как именно старческая брадитрофия тканей позволяет ставить вопрос о моделировании амилоидоза. На молодых крысах амилоидоз не воспроизводится из-за особенностей обмена веществ, а крысы старше 24 мес. погибают в ходе эксперимента. Для моделирования системного амилоидоза экспериментальным животным проводятся подкожные инъекции нативного яичного альбумина через день из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней.

У контрольных и опытных животных исследуется 6-часовой спонтанный диурез. Клубочковая фильтрация определяется по клиренсу эндогенного креатинина, рассчитывается канальцевая реабсорбция воды. Содержание натрия и калия в моче определяется методом пламенной фотометрии, содержание кальция – спектрофотометрически. Основные процессы мочеобразования и экскреция электролитов определяются по истечении 2 недель, 1 и 2 месяцев.

По истечении времени эксперимента (2 мес.) животные забиваются под наркозом. Морфологическому исследованию на предмет выявления амилоидоза (окраска гематоксилином и эозином, конго красным) подвергаются внутренние органы. Образцы тканей фиксируются в 10%-ном нейтральном формалине, с последующим приготовлением парафиновых срезов толщиной 5-6 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином, конго красным. Изучение срезов проводится в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением ×80, ×200, ×400.

Сущность заявляемого способа подтверждается функционально и морфологически.

Исследования показали, что в условиях спонтанного диуреза на фоне подкожного введения нативного яичного альбумина отмечается увеличение диуреза через 1 месяц и через 2 месяца (табл.1). Увеличение диуреза обусловлено повышением скорости клубочковой фильтрации (СКФ). В течение второго месяца эксперимента спонтанный диурез продолжает увеличиваться, несмотря на повышение канальцевой реабсорбции воды.

Экскреция натрия под влиянием амилоидогена в условиях спонтанного 6-часового диуреза повышается на протяжении обоих месяцев.

Экскреция калия и кальция под влиянием нативного яичного альбумина в условиях спонтанного диуреза возрастает на протяжении всего эксперимента, особенно по истечении 2 месяцев (табл.2).

Под влиянием введения нативного яичного альбумина отмечалось прогрессивное увеличение протеинурии более чем в 2 раза на протяжении 2 месяцев (табл.1).

Сущность заявляемого способа подтверждается морфологически.

Фиг.1. Отложение амилоида в клубочках и канальцах почек. Выраженная конгофилия клубочков и канальцев почек, отек интерстиция. Выраженная паренхиматозная дистрофия канальцев.

Фиг.2. Отложения амилоида в стенках сосудов почек, в основном в интиме и мышечном слое. Утолщение и разрыхление стенок сосудов.

Фиг.3. Отложение амилоида в печени преимущественно в центрах долек вокруг сосудов. Отмечается очаговая диффузная конгофилия гепатоцитов.

Фиг.4. Отложение амилоида в селезенке преимущественно вокруг лимфоидных фолликулов и в стенке сосудов.

Пример 1.

Проведены серии опытов из 2-х групп:

1-я группа – (10 крыс-самцов линии «Вистар» – контрольная.

2-я группа (10 крыс-самцов линии «Вистар») – амилоидная – животным проводились подкожные инъекции нативного яичного альбумина через день из расчета 0,025 мл/г массы тела крыс-самцов в возрасте 18-24 мес. в течение 60 дней.

Морфологическому исследованию на предмет выявления амилоидоза (окраска конго красным) подвергнуты внутренние органы, кровеносные сосуды.

В результате проведенных исследований получены морфологические доказательства эффективности применения нативного яичного альбумина для моделирования экспериментального амилоидоза у старых крыс-самцов.

Гистологически у 2-ой группы животных в почках (фиг.1) при окраске срезов конго красным отмечалась выраженная конгофилия медуллярных и кортикальных стромально-сосудистых структур (артериол и капилляров) почки, в большей степени проявлявшаяся в мальпигиевых клубочках, капсуле Шумлянского-Боумена, базальных мембранах канальцев, гистоструктурах почечной лоханки и чашечек. Выявлялась слабая эндотелиальная реакция капилляров клубочков и сосудов микроциркуляторного русла стромы почки, особенно коркового слоя.

Исходя из полученных результатов исследования обосновывается использование нативного яичного альбумина для моделирования амилоидоза у старых крыс.

Для наглядности изменений в органах микрофотографии повторяются в цветном виде в приложении.

Подводя итог, следует отметить, что подкожное введение старым крысам нативного яичного альбумина является эффективным способом моделирования экспериментального амилоидоза.

Формула изобретения

Способ моделирования экспериментального амилоидоза у животных, включающий введение животным подкожно через день нативного яичного альбумина в определенной дозе в течение срока эксперимента, отличающийся тем, что нативный яичный альбумин вводят старым крысам из расчета 0,025 мл/г массы тела в течение 60 дней эксперимента.

РИСУНКИ