Патент на изобретение №2373580
|
||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОСТРОГО ПОСТСТРЕПТОКОККОВОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
(57) Реферат:
Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной нефрологии, и может быть использовано для моделирования острого постстрептококкового гломерулонефрита. Для этого белой беспородной крысе вводят внутрибрюшинно 1 раз в день штамм Streptococcus pyogenes Dick-I с концентрацией 109 КОЕ/мл, в разведении 1:9, в дозе 0, 5 мл взвеси. Введение осуществляют по следующей схеме – 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней перерыва между циклами. Способ обеспечивает повышение воспроизводимости, сокращение времени эксперимента, удешевление методики, а также прост в исполнении.
Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, патологической физиологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для изучения патогенеза, морфогенеза острого постстрептококкового гломерулонефрита и доклинического исследования эффективности новых лекарственных препаратов.
Технический результат: упрощение способа моделирования острого постстрептококкового гломерулонефрита на животных, повышение воспроизводимости, сокращение времени эксперимента и удешевление методики. Указанные задачи достигаются путем многократной иммунизации белых беспородных крыс нефритогенным штаммом пиогенного стрептококка – Dick-I Streptococcus pyogenes (ГНИИ стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича) по новой схеме. Способ осуществляют следующим образом. Белых беспородных крыс иммунизируют инактивированной бактериальной суспензией эталонного штамма Dick-I Streptococcus pyogenes (ГНИИ стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича). Антигенную суспензию для иммунизации животных получают путем культивирования штамма на мясопептонном бульоне в аэробных условиях при температуре +37°С, центрифугирования суточной бульонной культуры Streptococcus pyogenes в течение 10-15 минут при скорости 3000 оборотов в минуту и последующего удаления супернатанта. Полученную взвесь концентрацией 109 КОЕ/мл, определяемой на КФК-3 (оптическая плотность 0,028, длина волны 540 нм, кювета – 1,060 мм), инактивируют при +56°С в течение 30 минут. Из расчета 50 мкл взвеси на 1 животное готовят разведение: 9 мл стерильного физиологического раствора и 1 мл взвеси (на 1 животное приходится 500 мкл (0,5 мл) полученной вновь взвеси антигенной суспензии). Иммунизацию животных проводят внутрибрюшинно 1 раз в день по схеме: 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней перерыва между циклами. Эксперимент выполнен на 30 животных – самцах и самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. Животные были разделены на 2 экспериментальные группы: I группа – контрольная (интактные животные); II группа – моделирование острого гломерулонефрита. I группа – контрольная (интактные животные), n=10; II группа – животные, иммунизированные бактериальной суспензией штамма Streptococcus pyogenes, n=20. II группа (опытная) была подразделена на 2 подгруппы, различающихся сроком забора органов (21 и 31 день). Перед началом эксперимента у животных контрольной (интактной) и опытной группы проводили анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой. В конце каждого цикла иммунизации у животных контрольной и опытной групп также исследовали разовую порцию мочи на белок. По окончании опыта животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забирали для проведения гистологического исследования. Результаты экспериментов подвергнуты статистической обработке с применением компьютерных программ Microsoft Excel и Biostat. У животных контрольной группы не было выявлено лабораторных и гистологических признаков развития гломерулонефрита. В течение всего эксперимента в моче животных этой группы белок не выявлялся. При проведении гистологического исследования в почках четко выявлялась капсула почки, корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами, мозговое вещество почки. Хорошо визуализировались сосочек и почечная лоханка, выстланная переходным эпителием. Сосудистые клубочки не были изменены, капсула не утолщена. Между почечными тельцами находились проксимальные и дистальные почечные канальцы с типичной структурой. Прямые канальцы в мозговом веществе и собирательные трубочки – без особенностей. При исследовании мочи на содержание белка у 90% иммунизированных животных к 21 дню иммунизации был положительный результат. На секции отмечались макроскопические признаки застойной сердечной недостаточности: общее венозное полнокровие; увеличение печени (печень плотная, темная); инъецированность сосудов брыжейки, имелись небольшие кровоизлияния. При проведении гистологического исследования аутопсийного материала, полученного от иммунизированных животных к 21 дню эксперимента, в ткани почек выявлялось полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев, большое количество увеличенных гиперцеллюлярных клубочков с резко уменьшенным мочевым пространством, инфильтрированных нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами, с мезангиальной пролиферацией. Отмечалось сужение просветов капилляров за счет пролиферации эндотелиальных и мезангиальных клеток, что обусловило лапчатость отдельных клубочков. Таким образом, в этом сроке отмечалась экссудативная фаза воспаления в клубочках. В проксимальных и дистальных канальцах нефронов имелись участки белковой дистрофии эпителия, воспалительная инфильтрация стромы преимущественно лимфоцитами с примесью небольшого количества нейтрофилов и гистиоцитов. При проведении гистологического исследования аутопсийного материала, полученного от иммунизированных животных к 31 дню эксперимента, в клубочках начинали преобладать процессы пролиферации, что выражалось в появлении наряду с мезангиальной и эндотелиальной пролиферацией отложения нитей фибрина и белковых масс в капсуле Боумена, сращении капилляров клубочка с капсулой и образовании микрополулуний в отдельных клубочках. Имелся тромбоз капилляров клубочков. Их базальная мембрана была утолщена. В проксимальных и дистальных канальцах отмечалась белковая дистрофия эпителия, в строме – воспалительная инфильтрация нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами. Воспроизводимость способа составила 100%. У всех животных после иммунизации развивались гистологические признаки острого гломерулонефрита. Примеры конкретного выполнения Пример 1. Самке беспородной белой крысы ( К концу 2 недели иммунизации в моче животного отмечалась положительная реакция на белок. При исследовании в проходящем свете образцов почечной ткани, окрашенных гематоксилином и эозином, выявлялось полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев, большое количество увеличенных гиперцеллюлярных клубочков с резко уменьшенным мочевым пространством, инфильтрированных нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами, с мезангиальной пролиферацией. Отмечалось сужение просветов капилляров за счет пролиферации эндотелиальных и мезангиальных клеток. В проксимальных и дистальных канальцах нефронов имелись участки белковой дистрофии эпителия, воспалительная инфильтрация стромы преимущественно лимфоцитами с примесью небольшого количества нейтрофилов и гистиоцитов. Пример 2. Самцу белой беспородной крысы ( При исследовании разовой порции мочи на белок при помощи качественной реакции с 20% сульфосалициловой кислотой выявлена положительная реакция в конце 2 недели иммунизации. При проведении гистологического исследования аутопсийного материала в клубочках наряду с мезангиальной и эндотелиальной пролиферацией наблюдались отложения нитей фибрина и белковых масс в капсуле Боумена, сращение капилляров клубочка с капсулой и образование микрополулуний в отдельных клубочках. В части клубочков имелся тромбоз капилляров. Базальная мембрана капилляров клубочка была утолщена. В проксимальных и дистальных канальцах отмечалась белковая дистрофия эпителия, в строме – воспалительная инфильтрация нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами. Предлагаемый способ позволяет изучить патогенез, морфогенез острого постстрептококкового гломерулонефрита и проводить доклинические исследования эффективности новых лекарственных препаратов для лечения острого постстрептококкового гломерулонефрита у людей.
Формула изобретения
Способ моделирования острого постстрептококкового гломерулонефрита в эксперименте путем многократного введения штамма Streptococcus pyogenes лабораторному животному, отличающийся тем, что в качестве лабораторного животного используют белую беспородную крысу, которой вводят внутрибрюшинно 1 раз в день штамм Streptococcus pyogenes Dick-I с концентрацией 109 КОЕ/мл, в разведении 1:9, в дозе 0,5 мл взвеси по следующей схеме – 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней перерыва между циклами.
|
||||||||||||||||||||||||||
5-6, с.623-630. RU 2134454 С1, 10.08.1999. SU 1617455 A1, 30.12.1990. NORDSTRAND A. et al. Streptokinase as a mediator of acute post-streptococcalglomerulonephritis in an experimental mouse model. Infect Immun. 1998 Jan; 66(1):315-21. HOLM SE et al. A streptococcal plasminogen activator in the focus of infection and in the kidneys during the initial phase of experimental streptococcal glomerulonephritis. APMIS. 1988 Dec; 96(12):1097-108.