Патент на изобретение №2373529

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ РЕЦИДИВОВ У БОЛЬНЫХ ЛЕПРОЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской диагностике. Предложен способ прогнозирования риска возникновения рецидива лепры. При исследовании генотипа больных лепрой определяют гаплотип генотипа HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08 в крови больного и по его наличию прогнозируют риск возникновения рецидива. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования и может быть, в частности, использовано для прогнозирования возникновения рецидива лепрозного процесса.

Из практики медицины известно о способе прогнозирования рецидивов у больных лепрой (Маслов А.К., Ющенко А.А., а.с. 1636717), основанный на определении активности пероксидазы в митохондриях макрофагов, мембранах клеток и перимикобактериальной зоне. Показано, что при наличии пероксидазо-активных митохондрий от 76,5% и ниже от нормы и отсутствии активности пероксидазы на мембранах клеток прогнозируют рецидив. Недостатками этого способа являются: трудоемкость и труднодоступность способа, связанная с использованием электронного микроскопа и подготовкой материала для просмотра, что не дает возможность получить конкретный технический результат – повышение эффективности способа.

Кроме того, известен способ определения группы риска возникновения рецидива лепры (Дячина М.Н., Дегтярев О.В., патент 2082979), заключающийся в определении в сыворотке крови больных антител к нативному и полусинтетическому антигенам Mycobacterium leprae. Показано, что при увеличении оптической плотности по сравнению с нормой в 2 и более раза определяют группу «риска» рецидива лепры. Недостатком этого способа является то, что диагностика риска рецидива лепры происходит практически на стадии уже сформировавшегося инфекционного процесса.

Измеряемый иммунологический показатель (степень выраженности реакции между антигенами возбудителя и сывороточными антителами к нему) представляет собой свидетельство присутствия персистирующих жизнеспособных M.leprae в тканях периферической нервной системы и внутренних органов больного и практически по сути своей только подтверждает уже свершившийся факт активации лепрозного процесса, проявившийся в виде нарастания антительного ответа на антигены возбудителя. При этом уровень оптической плотности образцов практически не отличается от такового у больных с активным процессом. Это, во-первых, не разграничивает понятия активации и рецидива инфекционного процесса, что следует также и из авторского описания указанного способа, а во-вторых, не позволяет своевременно провести комплекс индивидуальных профилактических мероприятий, предупреждающих рецидивирующее течение лепрозного процесса.

Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат – повышение эффективности способа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования риска возникновения рецидива у больных лепрой, предложенный Барановым Ю.Н. «Генетические маркеры и рецидивы у больных лепрой» («Актуальные вопросы лепрологии», Астрахань, 1978 г., с.41-42).

Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что в обоих способах применен генетический подход, основанный на изучении генетических особенностей человека.

Сущность этого способа состоит в определении групп крови системы АВО и особенностей пальцевой дерматоглифики. Недостаточная эффективность известного способа заключается в:

– сложности определения пальцевого узора у больных лепрой, обусловленной трофическими изменениями концевых фаланг пальцев кисти, что в итоге затрудняет проведение данного исследования;

– различиях в трактовке результатов по половому признаку, что сужает диагностический диапазон данного способа.

Таким образом, перечисленные недостатки не позволяют получить конкретный технический результат – повышение эффективности способа.

Рецидивы при лепре являются одной из проблем, осложняющих борьбу с этой инфекцией. Возникновение рецидива обычно приводит к повторной госпитализации, увеличивает степень инвалидизации больных и осложняет эпидемическую ситуацию.

Определенную роль в развитии рецидивов играют провоцирующие факторы экзо- и эндогенного характера. К эндогенным следует отнести изменения гормонального статуса. В настоящее время в связи с постарением контингента больных лепрой это может быть связано с гормональной перестройкой в климактерическом периоде. Хронические заболевания (болезни сердечно-сосудистой системы, поражения печени и почек и др.) также могут способствовать развитию рецидива. Кроме того, анализ материалов по рецидивам лепры позволил выявить следующие экзогенные факторы: психотравмы, злоупотребление алкоголем, инфекционные заболевания, переохлаждения, чрезмерная физическая нагрузка (Каданцев Н.Д., Коган В.Р. «Актуальные вопросы лепрологии», Астрахань, 1984, с.106-109).

Наибольшее значение среди факторов риска возникновения рецидива имеют нарушения режима лечения. Вместе с тем, несмотря на полноценную противолепрозную терапию у одних больных отмечаются рецидивы и даже многократные, а у других их не бывает совсем.

Этот факт дает основание предположить роль наследственных факторов в возникновении рецидивов у больных лепрой.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу – повышение эффективности способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Предлагаемый способ состоит в том, что определяют генотип

HLA-DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08 в крови больного и по его наличию прогнозируют риск возникновения рецидива лепрозного процесса.

Таким образом, реализуется положительный результат изобретения, суть которого состоит в повышении эффективности способа.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Выделение ДНК проводили по методу Higuchi (R.Higuchi H.Erlich «Using PCR to engineer DNA, In: PCR Technology», Stockton Press, New York, N.Y., 1989, р.61-70) с некоторыми модификациями. 0,5 мл крови, взятой с ЭДТА в качестве антикоагулянта, смешивали в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл типа Эппендорф, содержащих 0,5 мл лизирующего раствора. Состав лизирующего раствора: 0,32 М сахарозы, 10 мМ Трис – HCl буфера pH 7,5, 5 мМ MgCl₂, 1% Тритона Х-100. Центрифугировали в течение 1 мин при 10000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза промывали вышеуказанным раствором. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50 мМ KCI, 10 мМ Трис-HCl pH 8,3; 2,5 мМ MgCl₂, 0,45% NP-40, 0,45% Твина-20 и 250 мкг/мл протеиназы К при 37°С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К нагреванием в твердотельном термостате при 95°С в течение 5 мин. Полученные образцы ДНК сразу использовали для типирования либо хранили при -20°С. Концентрация ДНК, определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-флуориметре (Hoefer, США), составляла от 50 до 100 мкг/мл. Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 мин. Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2 мМ каждого из дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ), 67 мМ Трис-HCl pH 8,8; 2,5 мМ

MgCl₂, 50 мМ NaCl, 0,1 мг/мл желатина, 1 мМ 2-меркаптоэтанола, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы. Для предотвращения изменения концентраций компонентов реакционной смеси из-за образования конденсата реакционную смесь покрывали 20 мкл минерального масла. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере «Терцик» (ЗАО НПФ “ДНК-Технология”, Москва).

Типирование локуса DRB1 проводили в два этапа. Во время первого раунда геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках. В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRB1 (праймеры DRBsen и DRBas), а во второй – пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR3, DR5, DR6, DR8 (праймеры DR3568s и DRBas). В обоих случаях температурный режим амплификации (для термоциклера «Терцик») был следующим:

1. 94°С – 1 мин.

2. 94°С – 20 сек. 7 циклов

67°С – 2 сек.

3. 92°С – 1 сек. 28 циклов

65°С – 2 сек.

Полученные продукты разводили в 10 раз и использовали на втором раунде.

При амплификации на втором раунде использовали следующий температурный режим:

1. 92°С – 1 сек. 15 циклов

64°С – 1 сек.

Типирование локуса DQA1 проводилось в два этапа. На первом раунде использовалась пара праймеров, амплифицирующая все специфичности локуса DQA1, а на втором раунде использовались пары праймеров, амплифицрующие следующие специфичности *0101, *0102, *0103, *0201, *0301,*0401,*0501,*0601.

Первый раунд проводили по программе:

1. 94°С – 1 мин.

2. 94°С – 20 сек. 7 циклов

58°С – 5 сек.

3. 92°С – 1 сек. 28 циклов

56°С – 2 сек.

Продукты амплификации первого раунда разводили в 10 раз и использовали на втором раунде по следующей программе:

1. 93°С – 1 сек. 12 циклов

62°С – 2 сек.

Типирование локуса DQB1 также проводилось в два этапа. На первом раунде использовали пару праймеров, амплифицирующую все специфичности локуса DQB1. Температурный режим был следующий:

1. 94°С – 1 мин.

2. 94°С – 20 сек. 7 циклов

67°С – 5 сек.

3. 93°С – 1 сек. 28 циклов

65°С – 2 сек.

На втором раунде использовали пары праймеров, амплифицирующие следующие специфичности: *0201, *0301, *0302, *0303, *0304, *0305, *04, *0501, *0502, *0503, *0601, *0602/08. Продукты первого раунда разводили в 10 раз и проводили амплификацию в следующем температурном режиме:

1. 93°С – 1 сек. 12 циклов

67°С – 2 сек.

Электрофорез проводили при напряжении 200-250 V в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Время проведения электрофореза: после окончания I этапа – 10 минут, после окончания II этапа – 20 минут. Продукты амплификации видны в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета в ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм на трансиллюминаторе (Fluorescent tables combi-light, France). В качестве маркера длин использовали перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp I.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицей (таблица 1) и примерами.

Вывод: в таблице 1 показано, что у больных с рецидивами лепрозного процесса гаплотип HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08 встречается в 21,6% случаев, что существенно отличается от группы больных, не имеющих в своем генотипе данный гаплотип (8,7%). Таким образом, у больных, имеющих данный гаплотип, риск развития рецидива в 2,5 раза выше, чем у больных, не имеющих данный гаплотип.

Предлагаемый способ был апробирован на 94 больных, находящихся на лечении и диспансерном наблюдении в ФГУ «НИИ по изучению лепры Росздрава», г.Астрахань, в течение 9 лет с 1999 по 2007 годы.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1

Больной Л-ой, 1929 г.р. (история болезни 2461). Болен лепрой с 1953 года. В 1955 году впервые госпитализирован в клинику НИИ по изучению лепры с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Клинически заболевание характеризовалось наличием поверхностной диффузной инфильтрации с нарушением чувствительности в области лица, на голенях и ягодицах. Лепроминовая проба была отрицательной. После курса химиотерапии был выписан на амбулаторное лечение в 1962 году. При выписке кожные покровы свободны от специфических высыпаний, БИН=0. Гистологическое исследование биоптата кожи: хорошо регрессирующий лепроматозный инфильтрат с фиброзом дермы. Находясь на амбулаторном лечении, больной постоянно получал противолепрозную терапию. В 1991 г. больной поступил с рецидивом заболевания. На кожном покрове живота, ягодиц очаговые инфильтраты и пятна розовато-синюшного цвета. Гистологическое исследование биоптата кожи: активно формирующийся инфильтрат лепроматозной структуры, содержащий большое количество гомогенных микобактерий. БИН=0,16+. После проведенных курсов комбинированной химиотерапии процесс на коже регрессировал, БИН=0, в гистологическом препарате определялись периваскулярные инфильтраты нехарактерной структуры без микобактерий лепры. В 1994 г. больной выписан на амбулаторное лечение.

В период апробации способа проведено генетическое исследование. У больного брали кровь из вены в количестве 1,5 мл, определяли генотип и прогнозировали риск возникновения рецидива заболевания. Геномную ДНК выделяли из периферической крови методом высаливания по стандартной процедуре, указанной выше. Для типирования генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) использовали реактивы НПФ «ДНК-технология» (Россия). Реакцию амплификации проводили на амплификаторе «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология») по программам, указанным выше. Детекцию продуктов амплификации проводили при помощи электрофореза в 3% агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

После типирования у больного выявлен гаплотип

HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08.

Таким образом, по наличию в крови у больного гаплотипа

HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08 можно спрогнозировать риск возникновения рецидива лепрозного процесса.

Пример 2

Больной А-ов, 1942 г.р. (история болезни 3070). Болеет лепрой с 1962 года. Первичный диагноз: лепра, лепроматозный тип. После курса химиотерапии был выписан на амбулаторное лечение в 1967 году. При выписке кожные покровы свободны от специфических высыпаний, сохранилась легкая синюшность кожи в области лба. Гистологическое исследование биоптата кожи: регрессирующего характера лепроматозный инфильтрат. В 1974 году больной поступил с рецидивом заболевания. На коже туловища, плеч, ягодиц, бедер отмечалась поверхностная инфильтрация. В соскобе слизистой носа и скарификатах кожи обнаруживались палочки лепры. После проведенных курсов противолепрозной терапии участки инфильтрации регрессировали, в соскобах из носа и скарификатах микобактерии лепры отсутствовали, в гистологическом исследовании биоптата кожи: небольшие инфильтраты в дерме. В 1975 году выписан на амбулаторное лечение. В 1983 г. больной вновь поступил с рецидивом заболевания. БИН=0,85+, в гистологическом исследовании биоптата кожи: активно формирующийся инфильтрат лепроматозной структуры, содержащий большое количество гомогенных микобактерий. Больной принял несколько курсов комбинированного противолепрозного лечения и с регрессом заболевания выписан на амбулаторное лечение в 1987 году.

Прогнозирование риска возникновения рецидива лепрозного процесса осуществляли способом, описанным в примере 1.

После типирования у больного выявлен гаплотип HLA

DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08.

Таким образом, по наличию в крови у больного гаплотипа

HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08 можно спрогнозировать риск возникновения рецидива лепрозного процесса.

Пример 3

Больная Ю-на, 1938 г.р. (история болезни 1813). Болеет лепрой с 1948 года. Первичный диагноз: лепра, туберкулоидный тип. В 1971 и 1973 годах госпитализирована в клинику НИИ по изучению лепры с рецидивами заболевания с диагнозом: лепра, лепроматозный тип, специфический полиневрит с чувствительными и трофическими нарушениями. Клинически заболевание характеризовалось очаговой инфильтрацией на коже туловища, ягодиц, верхних и нижних конечностей. Локтевые нервы были умеренно утолщены, слегка болезненны, анестезия до верхней трети плеч, трофические язвы стоп. В гистологическом исследовании биоптата кожи: инфильтраты в дерме лепроматозной структуры с наличием большого количества гомогенных микобактерий. Больная приняла несколько курсов комбинированного противолепрозного лечения и с регрессом заболевания выписана на амбулаторное лечение в 1975 году.

Прогнозирование риска возникновения рецидива лепрозного процесса осуществляли способом, описанным в примере 1.

После типирования у больной выявлен гаплотип

HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08.

Таким образом, по наличию в крови больной гаплотипа

HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08 можно спрогнозировать риск возникновения рецидива лепрозного процесса.

Пример 4

Больной Д-ков, 1944 г.р. (история болезни 2983). Болеет лепрой с 1961 года. В 1961 году впервые госпитализирован в клинику НИИ по изучению лепры с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. После двух курсов комбинированной химиотерапии проявления лепрозного процесса регрессировали и в декабре 1966 г. был выписан на амбулаторное лечение. При выписке кожные покровы свободны от специфических высыпаний, БИН=0. Находясь на амбулаторном лечении, больной получал курсы противолепрозной терапии. В 1975 и в 1982 годах поступал с рецидивами лепрозного процесса. Больной получал курсы комбинированного лечения, в результате чего инфильтративные проявления на коже исчезли, в гистологическом исследовании биоптатов кожи определялась нехарактерная периваскулярная инфильтрация без M.leprae. С 1982 г. больной находился на амбулаторном лечении. Он аккуратно принимал все курсы противолепрозной терапии, периодически ложился в клинику НИИЛ для лечения сопутствующих заболеваний. За все время амбулаторного лечения и наблюдения у больного были бактериоскопически отрицательные соскобы со слизистой носа и скарификаты с кожи, на кожном покрове не отмечалось активных проявлений лепрозного процесса.

В период апробации способа проведено генетическое исследование крови в 2000 г. Прогнозирование риска возникновения рецидива лепрозного процесса осуществляли способом, описанным в примере 1.

После типирования у больного выявлен гаплотип HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08.

В феврале 2007 г. больной стал предъявлять жалобы на появление высыпаний на коже туловища, конечностей. Объективно: на коже груди, живота отечные ярко-розового цвета пятна с нечеткими краями, на верхних конечностях инфильтрация носит сливной характер, локтевые и малоберцовые нервы утолщены, болезненны. Гистологическое исследование биоптата кожи: инфильтрат лепроматозной структуры, содержащий гомогенные и зернистые M.leprae. Скарификаты кожи со спины, поясницы, груди, бедер, предплечий бактериоскопически положительные. БИН=1+. Больному поставлен диагноз: рецидив лепрозного процесса.

Таким образом, по наличию в крови больного гаплотипа

HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08 был спрогнозирован риск возникновения рецидива лепрозного процесса задолго до его появления.

Пример 5

Больная С-ва, 1923 г.р. (история болезни 3781). Болеет лепрой с 1980 года. В 1989 году впервые госпитализирована в клинику НИИ по изучению лепры с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Клинически заболевание характеризовалось очаговой и диффузной поверхностной инфильтрацией с множеством дермальных лепром. Локтевые нервы и малоберцовые нервы были утолщены, поверхностные виды чувствительности снижены. Трофическая язва на подошвенной поверхности левой стопы. БИН=2,16+. Гистологически: активно формирующаяся гранулема погранично-лепроматозного типа с наличием гомогенных и зернистых форм микобактерий лепры.

Больной проводилось комбинированное лечение противолепрозными препаратами. В 1997 году была выписана на амбулаторное лечение. При выписке кожные покровы свободны от специфических высыпаний, БИН=0. Гистологическое исследование биоптата кожи: периваскулярная инфильтрация нехарактерной структуры без микобактерий лепры.

Прогнозирование риска возникновения рецидивов у больных лепрой осуществляли способом, описанным в примере 1.

После типирования у больной выявлен гаплотип

HLA DRB1-01-DQA1-0101-DQB1-0501.

Таким образом, отсутствие в крови больной гаплотипа

HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08 позволяет прогнозировать безрецидивное течение заболевания (отсутствие риска возникновения рецидива).

Пример 6

Больной С-ков, 1934 г.р. (история болезни 1913). Болеет лепрой с 1949 года. В 1949 году впервые госпитализирован в НИИ по изучению лепры с диагнозом: лепра, лепроматозный тип. Клинически заболевание характеризовалось диффузной поверхностной инфильтрацией. Чувствительность в зонах иннервации периферических нервов сохранена. В соскобе со слизистой носа и пунктатах из лимфатических узлов обнаружены микобактерии лепры. Гистологически: инфильтрат лепроматозной структуры с наличием единичных микобактерии лепры.

После проведенных курсов противолепрозного лечения процесс регрессировал и в 1963 году больной был выписан на амбулаторное лечение. При выписке кожные покровы свободны от специфических высыпаний, БИН=0. Гистологическое исследование биоптата кожи: остаточные инфильтраты типа простого воспаления без микобактерии лепры. За все время амбулаторного лечения и наблюдения у больного не отмечалось рецидивов заболевания. В клинику института поступал только для лечения сопутствующих заболеваний.

Прогнозирование риска возникновения рецидивов осуществляли способом, описанным в примере 1.

После типирования у больного выявлен гаплотип

HLA DRB1-07-DQA1-0201-DQB1-0201.

Таким образом, отсутствие в крови больного гаплотипа

HLA DRB1-13-DQA1-0102-DQB1-0602/08 позволяет прогнозировать безрецидивное течение заболевания (отсутствие риска возникновения рецидива).

Применением предложенного способа по сравнению со способом-прототипом достигается положительный результат, заключающийся в повышении эффективности прогнозирования риска возникновения лепрозного процесса. Повышение эффективности способа достигается определением конкретного иммуногенетического маркера, определяющего риск возникновения рецидива лепрозного процесса, он может быть использован на всех стадиях лепрозного процесса, как на самых ранних, включая субклиническую стадию, так и на отдаленных стадиях антибактериальной терапии.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагаемый способ прогнозирования риска возникновения рецидивов у больных лепрой.

Предлагаемый способ может быть рекомендован к клиническому использованию в противолепрозных учреждениях и в процессе диспансеризации для прогнозирования риска возникновения рецидивов у больных лепрой.

Формула изобретения