Патент на изобретение №2373275
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ BIFIDOBACTERIUM PSEUDOCATENULATUM OV-17, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ, НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ГИГИЕНИЧЕСКИХ И КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
(57) Реферат:
Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-17 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и многих других причин [1, 4]. Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры – как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения. Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами – Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3, 6]. Анализ ДНК, начатый в 70-е годы, позволил идентифицировать новые виды бифидобактерий (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum) и расширить представления о видовом составе бифидофлоры человека и закономерностях ее становления [2, 5, 8]. Это дает основания считать, что при конструировании и назначении средств коррекции микрофлоры необходимо учитывать биоразнообразие видового состава бифидофлоры. Включение новых производственных штаммов бифидобактерии расширит номенклатуру и повысит эффективность разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально. Задачей настоящего изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-17 с высокой биологической активностью, устойчивостью к внешним воздействиям и средствам антибактериальной терапии, высокой кинетикой накопления биомассы на питательных средах при промышленном выращивании. Штамм В. pseudocatenulatum OV-17 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора под Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах (капсулы, таблетки, суспензии, суппозитории, аэрозоли), биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. pseudocatenulatum OV-17 может быть применен в производстве гигиенических и косметических средств, например кремов, гелей, косметических масок. Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-17, который может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности в составе бактерийных препаратов, биологически активных добавок, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Штамм В. pseudocatenulatum OV-17 в ходе технологического процесса в короткие сроки на производственных средах накапливает биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, кислой среде, нетоксичен, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры. Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации видов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека. Заявляемый штамм обладает следующими свойствами. Культурально-морфологические свойства штамма Клетки штамма В. pseudocatenulatum OV-17 представляют собой Грам + полиморфные, бесспоровые неподвижные, короткие, слегка изогнутые палочки с утолщением на обоих концах, расположенные одиночно или по 2-3 под углом в 60°. В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии через 16-24 часа роста имеют форму «кометы» с плотным ядром 2 мм в диаметре и вуалевидным хвостом до 7 мм. Физиолого-биохимические свойства штамма Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания – 37-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует лактозу, галактозу, раффинозу, эскулин, вариабельно арабинозу, ксилозу. Не ферментирует мальтозу, сахарозу, фруктозу, рамнозу, маннозу, целлобиозу, трегалозу, мелецитозу, сорбитол, салицин, маннитол. Тесты на уреазу, нитраты и индол – отрицательны. Генотипирование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 334365 и EU 334366. Культуральные свойства штамма Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. pseudocatenulatum OV-17 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 109 КОЕ/мл и органические кислоты – ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко не сквашивает; при культивировании в молоке значение кислотности составляет не более 34°Т. В таблице 2 представлены данные культивирования штамма В. pseudocatenulatum OV-17 в течение 96 часов на обезжиренном молоке и бифидум-среде.
Результаты, представленные в таблице 2, демонстрируют, что при длительном культивировании штамма В. pseudocatenulatum OV-17 при нарастании содержания органических кислот в культуральной жидкости не происходит снижения содержания жизнеспособных клеток бифидобактерий, что говорит о его высокой устойчивости к кислой среде. Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. pseudocatenulatum OV-17 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах накапливает биомассу бифидобактерий и органические кислоты в короткие сроки и с высокими показателями. Полученные результаты говорят о высокой устойчивости штамма В. pseudocatenulatum OV-17 к кислой среде. Антагонистическая активность штамма изучалась методом отсроченного антагонизма с тест-культурами патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (таблица 3).
Результаты, представленные в таблице 3, показали, что при нанесении тест-культур на суточную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-17, выращенную на агаризованной среде (метод перпендикулярных штрихов), их рост подавляется. Размер зон задержки роста свидетельствует о том, что штамм В. pseudocatenulatum OV-17 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых культур. Чувствительность к антибиотикам штамма В. pseudocatenulatum OV-17 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2. 1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.
Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к стрептомицину, неомицину, гентамицину, полимиксину, амикацину, налидиксовой кислоте, канамицину, тетрациклину, доксициклину и промежуточно устойчив к пефлоксацину, ванкомицину и ципрофлоксацину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен. Безвредность В опыте изучения острой токсичности штамма В. pseudocatenulatum OV-17 показана его полная безвредность: при введении белым мышам per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×107 КОЕ на животное гибели мышей не отмечено. Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. pseudocatenulatum OV-17 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 109 КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к кислой среде и широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным. Представленные данные изучения штамма В. pseudocatenulatum OV-17 позволяют сделать заключение об его перспективности при использовании как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения. Пример 1. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 для получения биологически активной добавки к пище в жидком виде. 1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-17 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов. 2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска). 3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска). 4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока – 0,5 л, пептон – 2 г, лактоза – 10 г, хлористый натрий – 5 г, цистеин – 0,2 г, агар-агар – 1 г, дистиллированная вода – 0,5 литра; рН среды – 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часов при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают. Пример 2. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта. 1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-17 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов. 2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска). 3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска). 4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 109 КОЕ/мл бифидобактерий. Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 106-7 КОЕ/мл или КОЕ/г. Пример 3. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 для получения бактерийного препарата. 1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-17 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов. 2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска). 3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска). 4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 КОЕ/мл бифидобактерий. К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 108 КОЕ/г живых клеток бифидобактерий. Пример 4. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище. Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 109 КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы Пример 5. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-17 для получения гигиенических и косметических средств. Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. pseudocatenulatum OV-17 с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема. Список литературы 1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.
3. Гончарова Г.И., Вильшанская Ф.Л., Ж. Микробиол., 1968, 4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.
7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04, 2004.
Формула изобретения
Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-17, коллекционный номер
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5, с.76-79.