Патент на изобретение №2373274
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) ШТАММ BIFIDOBACTERIUM BREVE OV-12, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ, ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ И НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ГИГИЕНИЧЕСКИХ И КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
(57) Реферат:
Штамм Bifidobacterium breve OV-12 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и множества других причин [1, 4]. Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры – как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения. Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами – Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3,6]. Применение современных подходов генотипирования бифидобактерии подтвердило присутствие В. breve в составе микрофлоры грудных детей [2, 5, 6, 8]. Включение новых производственных штаммов бифидобактерии расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально. Целью настоящего изобретения является штамм Bifidobacterium breve OV-12, который выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора под Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах, в том числе биологически активных добавок, капсул, таблеток, суспензий, суппозиториев; ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. breve OV-12 может быть применен в производстве гигиенических средств, например кремов, гелей, косметических масок. Техническим результатом заявленного изобретения является получение бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, которые в качестве действующего начала пробиотической направленности содержат штамм В. breve OV-12, в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливающего биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладающего антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, органическим кислотам, а также внешним воздействиям, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры. Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации штаммов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека. Заявляемый штамм обладает следующими свойствами. Морфологические свойства Клетки штамма В. breve OV-12 представляют собой Грам+ полиморфные, бесспоровые неподвижные крупные палочки с бифуркацией на одном конце, расположенные попарно крестообразно в виде хромосомы, буквы Х, Т, «рожек улитки». В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии имеют вид «комет» в форме елочек длиной до 1 см. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам. Физиолого-биохимические свойства Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания – 37,5-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует мальтозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мелецитозу, сахарозу, маннозу, вариабельно сбраживает раффинозу, ксилозу, арабинозу. Не ферментирует салицин, трегалозу, рамнозу, маннозу, эскулин, целлобиозу, сорбитол. На уреазу, нитраты и индол реакция отрицательна. Генотипирование штамма В. breve OV-12 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272015 и EU 272021. Культуральные свойства Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. breve OV-12 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 109 КОЕ/мл и органические кислоты – ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко сквашивает к 24 часам до 90°Т с образованием плотного сгустка. Максимальная кислотность в молоке – 150°Т. Данные изучения динамики накопления микробной массы и органических кислот (продуктов метаболизма) в процессе культивирования представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, в процессе культивирования происходит динамичное накопление микробной массы и органических кислот. Максимальные величины этих показателей отмечались к 24 часам культивирования. Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий на производственных и лабораторных средах с высокими показателями значения КОЕ/мл. Антагонистическая активность штамма изучалась на плотных питательных средах методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных микроорганизмов. Результаты, представленные в таблице 3, показали, что В. breve OV-12 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых штаммов.
Чувствительность к антибиотикам штамма В. breve OV-12 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.
Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к полимиксину, налидиксовой кислоте, амикацину, неомицину, канамицину, пефлоксацину, гентамицину, ципрофлоксацину, стрептомицину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен. Безвредность В опыте изучения острой токсичности штамма В.breve OV-12 показана его полная безвредность: при введении белым мышам дозы per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×107 КОЕ на животное, гибели мышей не отмечено. Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 109 КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным. Представленные данные изучения штамма В. breve OV-12 позволяют сделать заключение о перспективности его использования как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения. Пример 1. Использование штамма В. breve OV-12 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме 1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов. 2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска). 3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска). 4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока – 0,5 л, пептон – 2 г, лактоза – 10 г, хлористый натрий – 5 г, цистеин – 0,2 г, агар-агар – 1 г, дистиллированная вода – 0,5 литра; рН среды – 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают. Пример 2. Использование штамма В. breve OV-12 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта 1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов. 2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска). 3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска). 4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38 С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 109 КОЕ/мл бифидобактерий. Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 106-7 КОЕ/мл или КОЕ/г. Пример 3. Использование штамма В. breve OV-12 для получения бактерийного препарата 1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов. 2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска). 3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска). 4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 КОЕ/мл бифидобактерий. К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10 КОЕ/г живых клеток бифидобактерий. Пример 4. Использование штамма В. breve OV-12 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 109 КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы Пример 5. Использование штамма В. breve OV-12 для получения гигиенических и косметических средств Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. breve OV-12 с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема. Пример 6. Использование штамма В. breve OV-12 для получения кисломолочного продукта 1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов. 2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска). 3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска). 4-й пассаж: производственную закваску вносят в стерильное обезжиренное молоко в количестве 5% к его объему и культивируют при 37-38°С до сквашивания (в течение 16-18 часов). Готовый продукт охлаждают и разливают по 0,2 л в пластиковые стаканчики и укупоривают крышками из металлической фольги. Продукт содержит не менее 108 КОЕ/мл бифидобактерий. Литература 1. Бондаренко В.М., Мапулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300. 2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. /Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы – Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, 3. Гончарова Г.И., Вилыпанская Ф.Л., Ж. микробиол., 1968, 4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295. 5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. / Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. – Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, 6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. / Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника, – Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69. 7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2. 1890-04, 2004., 52 с. 8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. / Бифидобактерий: традиционный взгляд и современные генетические исследования: Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2,
Формула изобретения
Штамм Bifidobacterium breve OV-12, коллекционный номер
TK4A – Поправки к публикациям сведений об изобретениях в бюллетенях “Изобретения (заявки и патенты)” и “Изобретения. Полезные модели”
Напечатано: (57)
Следует читать: (57)
Номер и год публикации бюллетеня: 32-2009
Код раздела: FG4A
Извещение опубликовано: 20.03.2010 БИ: 08/2010
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
217. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, устойчив к широкому спектру антибиотиков, нетоксичен. Это позволяет использовать штамм В. breve OV-12 в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, обеспечивающих пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, а также обеспечивает расширение арсенала аналогичных средств. 4 табл.
19
28
ФГУН МНИИМ им. Г.Н.Габричевского