Патент на изобретение №2372406
|
|||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫМИ БАКТЕРИЯМИ РОДА PSEUDOMONAS И ACINETOBACTER
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает исследование смывов. Смывы фильтруют через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, на которых концентрируются бактерии, содержащиеся в минимальных количествах и/или покоящиеся формы, с последующим ПЦР-анализом элюированной тотальной ДНК с использованием родо- и видоспецифичных праймеров к данным бактериям. Изобретение позволяет повысить эффективность выявления обсемененности объектов внешней среды бактериями. 3 ил., 1 табл.
Изобретение относится к области медицины, а именно эпидемиологии и санитарной микробиологии. Эффективность микробиологического контроля санитарного состояния в стационарах различного профиля в значительной степени зависит от используемых при этом диагностических тестов. Решение этой задачи осложняется в ряде случаев неэффективностью бактериологической диагностики, поскольку в современных условиях циркуляция госпитальных штаммов может сопровождаться формированием некультивируемых форм бактерий (А.В.Соколенко, Т.Н.Мухина, 2006), не выявляемых традиционными культуральными методами. Известен способ планового бактериологического контроля в ЛПУ, основанный на определении общего микробного числа и наличия санитарно-показательных микроорганизмов (в том числе грамотрицательных бактерий группы кишечной палочки и др.) в соответствии с приказом МЗ СССР Недостатки прототипа: трудоемок, продолжителен во времени, не выявляет покоящиеся формы. Технический результат: сокращение сроков исследования, возможность выявления покоящихся форм грамотрицательных бактерий. Решение указанной задачи осуществляют следующим образом: при осуществлении санитарного контроля в лечебных учреждениях смывы с объектов внешней среды фильтруют через бактериальные фильтры, размеры пор которых обеспечивают концентрацию всех, в том числе покоящихся, форм бактерий, но исключают контаминацию фильтра случайными фрагментами ДНК. Затем фильтры помещают в пробирку с 1 мл сверхчистой воды, кипятят, центрифугируют, отделяют супернатант, из него осаждают тотальную ДНК изопропиловым спиртом и подвергают ПЦР-анализу с использованием видо- и родоспецифичных праймеров грамотрицательных бактерий. Способ осуществляют следующим образом: смывы получают стерильным ватным тампоном или марлевыми салфетками размером 5×5 см, для увлажнения которых используют стерильный физиологический раствор. При контроле мелких предметов смывы забирают с поверхности всего предмета. При контроле предметов с большой поверхностью смывы проводят в нескольких местах исследуемого предмета площадью в 100-200 см2. Тампоны и салфетки помещают во флакон с 200 мл физиологического стерильного раствора. В условиях ламинарного бокса с жестким соблюдением правил асептики и антисептики проводят осаждение бактерий на стерильных нитроцеллюлозных бактериальных фильтрах с фильтрующей поверхностью 25 мм и диаметром пор 0,22 мкм, используя фильтровальную установку с разрежением 150 мм рт.ст. Каждый образец смывов (200 мл) фильтруют через один фильтр. Количество фильтров определяется количеством проб, взятых на анализ. Далее фильтры стерильно переносят в пробирки типа «Эппендорф» с 1 мл сверхчистой воды, предварительно измельчив их стерильным скальпелем. Выделение тотальной ДНК для полимеразной цепной реакции проводят по методике, описанной G.G.Stone (1994). Эппендорфы с фильтрами прогревают 10 минут при температуре 97°С в твердофазном термостате «Термит», центрифугируют в течение 10 минут при 10000 об/мин, супернатант переносят в другую пробирку. Для концентрирования ДНК осаждают изопропанолом (1:1), центрифугируют 10 минут при 13000 об/мин, удаляют супернатант, подсушивают, осадок растворяют в 25 мкл ТЕ (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА) и используют для генетических исследований. Хранение образцов при температуре -18°С. Молекулярно-генетические исследования осуществляют путем ПЦР (specific PCR) с использованием праймеров (таблица), комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизмов (Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii и др.) и универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы (Pseudomonas, Klebsiella и др.).
Режим амплификации для праймеров AcinetF/AcinetR начальный цикл денатурации – 2 мин при 94°С, следующие 35 циклов: 94°С – 30 с; 50°С – 60 с; 72°С – 90 с и завершающий цикл – 5 мин при 72°С; для праймеров Ps-for/Ps-rev начальный цикл денатурации – 5 минут при 95°С, следующие 40 циклов: 94°С – 30 с; 65°С – 60 с; 72°С – 70 с, завершающий цикл – 10 мин при 72°С; для праймеров PA-SS-F/PA-SS-R начальный цикл денатурации – 2 мин при 95°С, далее 35 циклов: 94°С – 20 сек; 58°С – 20 сек; 72°С – 40 сек. Завершающий цикл 1 мин при 72°С. Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2% агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли после окрашивания геля бромистым этидием с использованием системы гель-документации BioDocAnalyze («Biometra», Германия). Для подтверждения эффективности предлагаемого способа генетического контроля микробной обсемененности объектов внешней среды в медицинских учреждениях проведено 10 исследований в двух крупных клиниках г.Перми. Примеры практического применения: Пример 1 Осуществлен контроль обсемененности объектов внешней среды грамотрицательными неферментирующими бактериями в общем отделении краевой инфекционной больницы г.Перми. Пробы были взяты со следующих объектов: Проведен ПЦР-анализ ДНК, полученной из проб вышеописанным способом с родо- и видоспецифичными праймерами к генам 16S РНК Pseudomonas spp. и А. baumannii. Путем амплификации с праймерами Ps-for/Ps-rev детектированы фрагменты, соответствующие размеру гена 16S РНК бактерий рода Pseudomonas (фиг.1). Одновременно был проведен бактериологический контроль в соответствии с приложением Пример 2 Проведен контроль обсемененности объектов внешней среды в хирургическом отделении областной краевой больницы г.Перми. Пробы взяты со следующих объектов: Амплификация с праймерами Ps-for/Ps-rev и PA-SS-F/PA-SS-R дала положительный результат с материалом из пробы Пример 3. Проведен контроль обсемененности грамотрицательными неферментирующими бактериями объектов внешней среды в палате интенсивной терапии КИБ Генетическое исследование осуществляли аналогичным способом с тремя видами праймеров. Бактериологическое исследование на синегнойную палочку и ацинетобактеры – отрицательное. В пробе Положительный эффект заявляемого способа состоит в более качественном контроле бактериальной обсемененности объектов окружающей среды в медицинских учреждениях, при этом учитываются некультивируемые формы микроорганизмов, которые при определенных условиях могут вызвать внутрибольничное инфицирование, но не выявляются с помощью существующего бактериологического метода.
Формула изобретения
Способ выявления обсемененности объектов внешней среды грамотрицательными бактериями рода Pseudomonas и Acinetobacter путем исследования смывов, отличающийся тем, что смывы фильтруют через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, на которых концентрируются бактерии, содержащиеся в минимальных количествах, и/или покоящиеся формы, с последующим ПЦР-анализом элюированной тотальной ДНК с использованием родо- и видоспецифичных праймеров к данным бактериям.
РИСУНКИ
|
|||||||||||||||||||||||||||
720 от 31.07.1978 г., приложение 
