Патент на изобретение №2371726

(54) КОМПЛЕКСНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (ИФА) ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСНЫМ РЕСПИРАТОРНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике вирусных заболеваний крупного рогатого скота. Предложена тест-система иммуноферментного анализа, позволяющая определить антитела к вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВИ) инфекциям крупного рогатого скота. Серологическое обследование животных позволяет определиить зоны распространения инфекции и оценить поствакцинальный иммунитет. Использование заявляемой тест-системы ИФА позволит проводить эпизоотологический мониторинг одновременно пяти важных инфекций крупного рогатого скота, ретроспективную диагностику респираторных инфекций, оценку напряженности иммунитета у животных в результате применения вакцин, определение уровня колостральных антител у молодняка в первые недели (дни) жизни, оценку качества терапевтических препаратов. 10 табл.

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии и может быть использовано как для широкомасштабных, так и для выборочных исследований сывороток крови, молока, молозива животных на наличие специфических антител к возбудителям вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота.

Тест-система ИФА содержит 96-луночные микропланшеты, сенсибилизированные аффинно-очищенными антигенами вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респиратоно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВИ) инфекциями крупного рогатого скота, антиИРТ (положительную), антиВД-БС (положительную), антиПГ-3 (положительную), антиРС (положительную), антиАВИ (положительную) и нормальные (отрицательные) нативные контрольные сыворотки, конъюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, 20-кратный концентрат калийфосфатного буфера, неионный детергент, 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода и стоп-реагент. Тест-система повышает чувствительность иммунологической реакции и сокращает время для проведения диагностики и иммуномониторинга респираторных вирусных заболеваний.

Развитие промышленного животноводства, требующее создания производственных комплексов, обострило проблему респираторной патологии крупного рогатого скота (КРС) в хозяйствах РФ. По данным Халенева Г.А. (1975), Гуненкова В.В (1975), Сюрина В.Н. (1976), Соколова М.Н. (1978), Глотова А.Г. (1998), Мищенко В.А. (1991) и др., ведущую роль в респираторной патологии крупного рогатого скота играют вирусы парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВИ) инфекций.

Учитывая сходные эпизоотологические данные, клинические и патологоанатомические признаки заболеваний, вызываемых данной группой возбудителей, особую роль в диагностике занимают лабораторные исследования, которые включают обнаружение антигенов из патологического материала в реакции иммунофлуоресценции (РИФ), иммуноферментном анализе (ИФА), реакции диффузионной преципитации (РДП), выделение возбудителя из патологического материала в культурах клеток перевиваемых линий почки эмбриона коровы Taurus-1 (T-1), эпителия коронарных сосудов теленка (КСТ), легкого эмбриона коровы (ЛЭК), почки теленка (Пт-80), в первичных культурах клеток тестикул бычка (ТБ), почки эмбриона коровы (ПЭК), идентификацию выделенных изолятов в реакции диффузионной преципитации (РДП), реакции иммунофлуоресценции (РИФ), в реакции нейтрализации (РН), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции торможения гемадсорбции (РТГАд), обнаружение антител в сыворотках крови больных и переболевших животных в РН, реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции связывания комплемента (РСК).

Решающим условием организации необходимых мер борьбы с респираторными болезнями КРС является установление роли инфекционных агентов в этой патологии.

В ветеринарной практике широко применяется в целях диагностики метод иммуноферментного анализа (ИФА). Этот метод позволяет по наличию динамики антител к инфекционному агенту судить о протекании инфекционного процесса в организме животного.

Известен способ дифференциальной диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (RU 2306567 С2). Указанный способ позволяет определять антигены трех вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота и не позволяет определять антитела.

Вирус ИРТ вызывает заболевание КРС различных возрастных групп, проявляющееся поражением верхних дыхательных путей (у телят возможна пневмония), вагинитами, энцефалитами, конъюнктивитами и артритами. ИРТ – остропротекающая контагиозная болезнь КРС, наносящая значительный экономический ущерб, который складывается из снижения удоя в период болезни, увеличения сервис-периода и яловости коров, слабого развития молодняка и значительным процентом гибели и выбраковки телят.

Вирус диареи-болезни слизистых (ВД-БС) вызывает пневмоэнтериты у телят, аборты у коров в первой половине беременности, а заражение коров в более поздние сроки приводит к рождению телят с врожденными уродствами, слаборазвитых, толерантных, впоследствии превращающихся в постоянный источник инфекции в стаде.

Вирус парагриппа-3 (ПГ-3) вызывает у КРС респираторное заболевание, но наиболее характерной является латентная форма инфекции. ПГ-3 часто осложняет течение других болезней.

Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота – контагиозная болезнь, клинически проявляющаяся повышением температуры, снижением аппетита, затрудненным дыханием, одышкой, истечениями из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем.

Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота не вызывает большого отхода животных, но тяжелое и длительное течение с осложнениями приводит к потере продуктивности, вынужденному убою. Однако в отличие от других вирусных респираторных инфекций распространение и наносимый экономический ущерб этим заболеванием остаются изученными недостаточно, что связано, прежде всего, со сложностью выделения и культивирования PC-вируса. Это в свою очередь затрудняет получение в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью вирусного сырья для диагностических препаратов и средств специфической профилактики.

Аденовирусную инфекцию (АВИ) диагностируют преимущественно у молодняка КРС, она характеризуется острым течением, поражением органов дыхания, пищеварения, конъюнктивитом. У взрослых животных инфекция протекает бессимптомно. Установлено, что аденовирусы являются иммунодепрессантами и способствуют развитию вторичной инфекции. Клинико-эпизоотологическая диагностика АВИ КРС затруднена из-за сходства с другими заболеваниями, поэтому главная роль отводится лабораторной диагностике. Она основана на выделении аденовирусов из патологического материала в первичных культурах клеток тестикул бычка (ТБ), почки эмбриона коровы (ПЭК), легких эмбриона коровы (ЛЭК), идентификации выделенных изолятов в реакции диффузионной преципитации (РДП), реакции иммунофлуоресценции (РИФ), реакции связывания комплемента (РСК), электронной микроскопии, ретроспективной диагностике, исследовании парных проб сыворотки крови в серологических реакциях непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментного анализа (ИФА), реакции нейтрализации (РН). Однако методика получения первичных культур клеток трудоемкая. В связи с этим подбор универсальной перевиваемой культуры клеток является актуальной задачей.

РНГА используется для диагностики аденовирусной инфекции в России на протяжении более чем 15 лет. Единственным и существенным недостатком РНГА является то, что в качестве носителя для антигенов используются эритроциты барана. При этом длительность хранения таких препаратов не превышает шести месяцев.

Указанные инфекции возникают у КРС в виде моноинфекций, смешанных вирусных и вирусно-бактериальных.

Сущность иммуноферментной реакции заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного пероксидазой хрена, способном вызывать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.

Для исследования в лабораторию направляют свежие сыворотки крови от больных и переболевших животных, взятые в начале заболевания и через 7 дней, которые хранят при температуре минус 20°С и исследуют одномоментно. Специальной обработки сывороток перед исследованием не требуется. Сыворотки, гемолизированные или контаминированные бактериальной и грибковой флорой, для постановки ИФА не пригодны.

Из молока и молозива предварительно выделяют глобулиновую часть, содержащую антитела основных классов А, М и G, путем добавления 2% пепсина при 37°С для створаживания и отделения казеина, через 6-8 часов фильтруют с помощью ватно-марлевого фильтра и сепарируют для удаления жира и остатков казеина на сепараторе типа ОСБ. Устанавливают рН 7,2-7,4 и приливают постепенно по каплям равный объем 20% полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой (ММ) 6000 Да для концентрирования молочных иммуноглобулинов. Надосадок декантируют, осадок ресуспендируют в буфере 0,01 М калийфосфатном, содержащем 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2-7,4, и осаждают полиэтиленгликолем повторно дважды. Осадок третьего осаждения растворяют в половинном объеме данного буфера и диализуют 24 часа против этого же буфера для удаления ПЭГ и эуглобулинов. Центрифугируют 15 мин при 7-8 тыс. оборотов. Осадок отбрасывают. Надосадочную жидкость используют для проведения ИФА.

В состав заявляемой тест-системы входят следующие биологические и химические компоненты:

1. 96-луночные микропланшеты, сенсибилизированные аффинно-очищенными антигенами вирусов ИРТ штамма ТК-А (ВИЭВ)В2, ПГ-3 штамма ЗКСМ, ВД-БС штамма «Oregon С 24V», PC штамма «Randall» и АВИ штамма «В 10» в количестве 0,075-0,125 мкг на лунку 10 шт.

2. АнтиИРТ (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки 1) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см³, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.

3. АнтиВД-БС (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки 2) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см³, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.

4. АнтиПГ-3 (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки 3) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см³, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.

5. АнтиАВИ (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки 4) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см³, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.

6. АнтиРС (положительная) сыворотка КРС (лунки C1, D1 плашки 5) 1 амп. (фл.), объем 0,005 см³, рабочее разведение 1:200, титр в ИФА не ниже 1:12600.

7. Нормальная (отрицательная) контрольная сыворотка (лунки А1, В1 всех пяти плашек) 5 амп. (фл.), объем 0,005 см³, рабочее разведение 1:200.

8. Антивидовой иммунопероксидазный (анти-IgG КРС) коньюгат 1 амп. (1 фл.) объемом 1 см³, 5 амп. (флаконов). Активность коньюгатов указана на этикетках ампул (флаконов).

Химические компоненты:

9. 20-кратный концентрат инкубационного буфера (0,2 М калийфосфатный буфер, содержащий 3 М натрия хлористого, рН 7,3), объем 1 фл. 50 см³, 5фл.

10. 10-кратный концентрат субстратного буфера (1,5 М фосфатно-цитратный буферный раствор, рН 5,0), 5 фл. Объем 5 см³.

11. Твин-20, -40, -80 или Тритон Х-305, 5 фл. 1 см³.

12. Ортофенилендиамин (ОФД) 5фл., 20 мг.

13. Гидроперит (Н₂O₂) 5 табл., 0,5 г.

14. Стоп-реагент – 1 М раствор серной кислоты, 5 фл., объем 10 см³. Срок годности препаратов при хранении в холодильнике (температура 2-8°С) 1 год.

1. Приготовление рабочих растворов

1.1. Инкубационный фосфатно-солевой твиновый буферный раствор предназначен для разведения контрольных исследуемых сывороток и антивидового конъюгата, а также для промывки панелей. Содержимое флакона с 20-кратным калийфосфатным буфером доводят дистиллированной водой до 1000 см³ и растворяют в этом объеме 1 см³ Твина-20, -40, -80 или Тритона Х-305. Инкубационный буфер представляет собой прозрачный раствор с рН 7,2-7,4. Срок хранения 7 дней при температуре от 2 до 8°С.

1.2. Для приготовления субстратного цитратно-фосфатного буферного раствора рН 5,0-5,2 растворяют содержимое флаконов 10 с 10-кратным цитратно-фосфатным буфером до 50 см³ дистиллированной водой.

Раствор субстрата готовят не ранее чем за 10 мин до внесения в лунки панелей. Для этого 20 мг ортофенилендиамина растворяют в 2 см³ спирта-ректификата, добавляют 48 см³ субстратного буфера и вносят 0,8 см³ раствора перекиси водорода, полученного растворением гидроперита в 10 см³ дистиллированной воды. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет. Субстратный буфер хранению не подлежит.

2. Приготовление антигена вируса ИРТ

Известен способ получения антигена вируса ИРТ для реакции ИФА (Технические условия 19.10.97-89 «Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», утвержденные ГУВ Госагропрома СССР 01.08.89), включающий репродукцию вируса ИРТ в культуре клеток ПТ-80, концентрирование вируссодержащей суспензии ультрафильтрацией, высокоскоростным ультрацентрифугированием, дезинтеграцию клеток ПТ-80 ультразвуком и осветление суспензии низкоскоростным центрифугированием.

Однако известный способ трудоемок и позволяет получить антиген, сильно загрязненный клеточными обломками, что сказывается на чувствительности реакции. Известны также способы получения антигена ИРТ для использования в ИФА в патентах RU 2196609, RU 2196336.

В заявляемом методе антиген вируса ИРТ готовится следующим способом. Монослой перевиваемой линии клеток МДВК после репродукции вируса ИРТ штамма ТК-А (ВИЭВ)В2 с активностью 7,5-8,5 lg ТЦД₅₀/см³ осаждают центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М калийфосфатном буфере, содержащем 0,15 М натрия хлористого, 0,1% Тритона X-100, рН 7,2-7,4. Полученную суспензию обрабатывают ультразвуком на аппарате типа УЗДН-21 мощностью 22 кГц импульсивно 6 раз по 30 секунд. После дезинтеграт центрифугируют при 5 тыс. об./мин в течение 25-30 мин. Образовавшийся осадок отбрасывают, а супернатант разводят в 10 объемах калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2-7,4. Полученную антигенсодержащую суспензию наносят на колонку с иммуносорбентом (BrCN агароза с иммобилизованными в качестве лиганда специфическими антителами к антигенам вируса ИРТ). После часовой инкубации в режиме реактора колонку промывают 10 объемами калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, 0,1% Тритона Х-100, рН – 7,2-7,4, и 5 объемами калийфосфатного буфера, содержащего 0,15 М натрия хлористого, рН 7,2-7,4. После промывки колонки антигены элюируют 0,1 М глициновым буфером, рН 2,2. Полученный таким образом антиген вируса ИРТ является комплексом гликопротеинов с молекулярной массой от 54 до 180 килодальтон.

В заявляемом методе получения антигена ИРТ мы изменили культуру клеток при репродукции вируса на МДВК и ввели более щадящий элюирующий буфер с другим значением рН – 0,1 М глициновый буфер, рН 2,2, что позволило получать более активный в ИФА антиген.

Оптимальную концентрацию антигена вируса ИРТ для сенсибилизации микропанелей исследовали шахматным титрованием его с положительной антиИРТ сывороткой в ИФА (таблица 6).

Пример 1. Антиген ИРТ в концентрации 0,75 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при 37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Затем в лунки микропланшета добавляют по 0,1 см³ положительной контрольной сыворотки в разведениях от 1:200 до 1:3200 в инкубационном буфере. После часовой инкубации при 37°С и пятикратной промывки инкубационным буфером в каждую лунку добавляют по 0,1 см³ рабочего разведения антивидового иммунопероксидазного конъюгата и инкубируют в течение часа при 37°С. Затем микропланшеты пятикратно отмывают инкубационным буфером и проявляют реакцию субстратным буфером. Реакцию учитывают через 30 мин спектрофотометрически при длине волны 492 нм (ОП 492). Результаты выражают в оптических единицах (о.е.).

Пример 2. Антиген ИРТ в концентрации 1,0 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при 37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят, как описано в примере 1.

Пример 3. Антиген ИРТ в концентрации 1,25 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при 37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят, как описано в примере 1.

Пример 4. Антиген ИРТ в концентрации 0,50 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при 37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят, как описано в примере 1.

Пример 5. Антиген ИРТ в концентрации 1,50 мкг/см³ калийфосфатного буфера, рН 7,2-7,4, разливают по 0,1 см³ в лунки микропланшета для постановки ИФА, после часовой инкубации при +37°С пятикратно промывают тем же буфером и просушивают в течение получаса при комнатной температуре. Реакцию ИФА и учет результатов проводят, как описано в примере 1.

По результатам шахматного титрования антигена и сыворотки в реакции ИФА установлена оптимальная рабочая концентрация аффинно-очищенного антигена вируса ИРТ – 1 мкг/см³ адсорбционного буфера при разведении антиИРТ сыворотки

1:200 в инкубационном буфере.

3. Приготовление антигена респираторно-синцитиального вируса

PC-вирус, штамм «Randall», с титром инфекционности 3,5-3,9 lg ТЦД ₅₀/мл, репродуцированный в перевиваемой культуре клеток почки теленка ПТ-80 или перевиваемой линии ВНК-21.

Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Концентрирование PC-вируса проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.

В работе по очистке PC-вируса от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные PC-вирусом клетки ПТ-80.

Белки PC-вируса штамма «Randall» отщепляли путем обработки вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100.

Для изучения белков, входящих в состав PC-вируса КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждали в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводили в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 V.

Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к PC-инфекции животных, определялись посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивали, а переносили на нитроцеллюлозную мембрану “Immobilon-NC” (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, использовались вирусспецифическая положительная сыворотка и аффинно-очищенные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена.

Концентрированные и очищенные белки PC-вируса, отщепленные Тритоном Х-100, были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.

Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения антиРСВ антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки антиРСВ IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные антиРСВ IgG пришивали к активированной BrCN Сефарозе 4В в количестве 8 мг белка на 1 мл геля согласно инструкции производителя.

После заполнения колонки анти-РСВ IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1 М глицин-НСl и забуференным физиологическим раствором (ЗФР), затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при 4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1 М глицин-HCl, рН 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1 М NaOH.

Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5-50 мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3 кД при давлении 0,3 мПа до концентрации белка 0,1 мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.

Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины PC-вируса практически без примесей.

Специфичность аффинно-очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с антиРСВ сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ.

Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов PC-вируса из вируссодержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены PC-вируса.

Пример 6. По результатам шахматного титрования антигена и сыворотки в реакции ИФА установлена оптимальная рабочая концентрация аффинно-очищенного антигена РС-вируса – 0,75 мкг/см³ адсорбционного буфера при разведении антиРС сыворотки 1:200 в инкубационном буфере и показана высокая чувствительность заявляемой тест-системы (Таблица 7).

4. Приготовление антигена вируса аденовирусной инфекции (АВИ)

Вирус АВИ, штамм «Bovine 10» (серотип 1), с титром инфекционности 4,0-4,5 lg ТЦД ₅₀/мл репродуцировали в перевиваемой культуре клеток почки теленка Т-1.

Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Концентрирование вируса АВИ проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифутированием.

В работе по очистке вируса АВИ от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом АВИ клетки Т-1.

Белки вируса АВИ штамма «Bovine 10» отщепляли путем обработки вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100.

Для изучения белков, входящих в состав вируса АВИ КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждали в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводили в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 V.

Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к АВИ животных, определялись посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивали, а переносили на нитроцеллюлозную мембрану “Immobilon-NC” (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, использовались вирусспецифическая положительная сыворотка и аффинно-очищенные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена.

Концентрированные и очищенные белки вируса АВИ, отщепленные Тритоном Х-100, были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.

Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения антиАВИ антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки антиАВИ IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные антиАВИ IgG пришивали к активированной BrCN Сефарозе 4В в количестве 8 мг белка на 1 мл геля согласно инструкции производителя.

После заполнения колонки антиАВИ IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1М глицин-HCl и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при 4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1 М глицин-HCl, рН 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1 М NaOH.

Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5-50 мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3 кД при давлении 0,3 мПа до концентрации белка 0,1 мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.

Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины вируса АВИ практически без примесей.

Специфичность аффинно-очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с антиАВИ сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ.

Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов вируса АВИ из вируссодержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены вируса АВИ.

5. Приготовление антигена вируса парагриппа-3

Вирус парагриппа-3 штамма «ЗКСМ» с титром инфекционности 6,0-7,0 lg ТЦД ₅₀/мл репродуцировали в перевиваемой культуре клеток почки теленка ПТ-80.

Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Концентрирование вируса ПГ-3 проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.

В работе по очистке вируса ПГ-3 от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом ПГ-3 клетки ПТ-80.

Белки вируса ПГ-3 штамма «Randall» отщепляли путем обработки вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100.

Для изучения белков, входящих в состав вируса ПГ-3 КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждали в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводили в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 V.

Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к ПГ-3 животных, определялись посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивали, а переносили на нитроцеллюлозную мембрану “Immobilon-NC” (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, использовались вирусспецифическая положительная сыворотка и аффинно-очищенные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена.

Концентрированные и очищенные белки вируса ПГ-3, отщепленные Тритоном Х-100, были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.

Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения антиПГ-3 антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки антиПГ-3 IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные антиПГ-3 IgG пришивали к активированной BrCN-Сефарозе 4 В в количестве 8 мг белка на 1 мл геля согласно инструкции производителя.

После заполнения колонки антиПГ-3 IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1 М глицин-HCl и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при 4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1 М глицин-HCl, рН 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1 М NaOH.

Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5-50 мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3 кД при давлении 0,3 мПа до концентрации белка 0,1 мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.

Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины вируса ПГ-3 практически без примесей.

Специфичность аффинно-очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с антиПГ-3 сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ.

Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов вируса ПГ-3 из вируссодержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены вируса ПГ-3.

6. Приготовление антигена вируса вирусной диареи-болезни слизистой

Вирус ВД-БС, штамм «Oregon C24 V», с титром инфекционности 5,5-6,5 lg ТЦД ₅₀/мл репродуцировали в перевиваемой культуре клеток МДВК.

Дезинтеграцию клеточных суспензий осуществляли на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т при 22 кГц в течение 10 секунд импульсивно 6 раз.

Концентрирование вируса ВД-БС проводили осаждением ПЭГ, высаливанием сульфатом аммония, ультрафильтрацией на полупроницаемых мембранах и осаждением ультрацентрифугированием.

В работе по очистке вируса ВД-БС от балластных белков использовали ультрацентрифугирование в градиентах сахарозы и Фикола-400. Плотность каждой фракции определяли на рефрактометре RL по составленным калибровочным кривым. В качестве контроля использовали дезинтегрированные ультразвуком незараженные вирусом ВД-БС клетки МДВК.

Белки вируса ВД-БС штамма «Oregon C24 V» отщепляли путем обработки вируссодержащей суспензии Тритоном Х-100.

Для изучения белков, входящих в состав вируса ВД-БС КРС, очищенную и концентрированную вируссодержащую суспензию разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), антигенную активность препарата подтверждали в иммуноблотинге (ИБ). ДСН-ПААГ проводили в буферной системе Laemmi в восстанавливающих условиях при постоянном напряжении 200 V.

Вирусные белки, индуцирующие выработку антивирусных антител у восприимчивых к ВД-БС животных, определялись посредством иммуноблотинга (ИБ). Для постановки ИБ белки после электрофоретического разделения не окрашивали, а переносили на нитроцеллюлозную мембрану “Immobilon-NC” (Millipore) в «полусухой» буферной системе при постоянной силе тока 200 мА в течение часа при комнатной температуре. Иммунохимическое окрашивание полученных реплик осуществляли с помощью непрямого ИФА с соблюдением всех его стадий. В качестве основных иммунологических реагентов, обеспечивающих формирование нерастворимого иммунного комплекса на мембране, использовались вирусспецифическая положительная сыворотка и аффинно-очищенные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена.

Концентрированные и очищенные белки вируса ВД-БС, отщепленные Тритоном Х-100, были иммобилизованы на BrCN Сефарозу 4В по стандартной методике.

Полученный таким образом иммуносорбент был использован для аффинного выделения антиВД-БС антител из сыворотки естественно переболевших животных. Элюированные с колонки антиРСВ IgG сразу переводили с помощью гель-хроматографии на Сефадексе G-25 в буфер для иммобилизации на носителе, концентрировали ультрафильтрацией и осветляли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут. Очищенные и концентрированные антиРСВ IgG пришивали к активированной BrCN-Сефарозе 4В в количестве 8 мг белка на 1 мл геля согласно инструкции производителя.

После заполнения колонки антиВД-БС IgG иммуносорбентом его трижды промывали 0,1 М глицин-HCl и ЗФР, затем уравновешивали ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100. Через подготовленную таким образом колонку пропускали вируссодержащую суспензию в режиме замкнутого реактора в течение 10 часов при 4°С. После отмывки колонки десятью объемами ЗФР, содержащим 0,1% Тритона Х-100, и пятью объемами ЗФР элюировали вирусные белки 0,1 М глицин-HCl, рН 2,5. Элюат немедленно нейтрализовали 1 М NaOH.

Элюируемые фракции контролировали путем отбора 5-50 мкл из собираемой фракции для неколичественного анализа по Бредфорду. Фракции, содержащие белок, объединяли и немедленно концентрировали для дальнейшего исследования ультрафильтрацией в ячейке ФМ001 на мембране с пределом исключения 3 кД при давлении 0,3 мПа до концентрации белка 0,1 мг/мл. Затем колонку уравновешивали адсорбирующим буфером или хранили в адсорбирующем буфере, содержащем 0,02% азида натрия.

Степень очистки белка определяли с помощью электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ полученного препарата. С помощью аффинной хроматографии удается выделить гликопротеины вируса ВД-БС практически без примесей.

Специфичность аффинно-очищенных гликопротеинов определяли в иммуноблотинге с антиВД-БС сывороткой КРС после электрофореза в 7,5% ДСН-ПААГ.

Таким образом, была получена матрица для одностадийной очистки антигенов вируса ВД-БС из вируссодержащих суспензий, использование которой позволяет практически без потерь выделять антигены вируса ВД-БС.

Пример 7. Аналогично примерам 1-6 в п.2 устанавливали оптимальные рабочие концентрации аффинно-очищенных антигенов вирусов ПГ-3, ВД-БС и АВИ – 1,0, 1,5 и 1,25 мкг/см³ адсорбционного буфера при разведении антиПГ-3 сыворотки 1:200, антиВД-БС сыворотки 1:200 и антиАВИ 1:200 в инкубационном буфере соответственно (Таблицы 8-10).

7. Приготовление контрольных сывороток

В качестве положительного контроля используют антиИРТ сыворотки, полученные от естественно переболевших ИРТ животных с титром в ИФА не ниже 1:12600. Для этого у животных проводят стерильное взятие крови из яремной вены в объеме 300-400 см³ от каждого животного. Кровь выдерживают в термостате при 37°С, затем делают обводку и для отстаивания сыворотки выдерживают 12-14 часов при 4°С. Затем сыворотку отделяют от сгустка крови, осветляют центрифугированием в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют на водяной бане при 56°С 40 мин. Затем сыворотку консервируют 0,02% азида натрия и разливают по 0,0005 см³ в ампулы.

Аналогично готовили положительные сыворотки: антиВД-БС, антиПГ-3, антиРС, антиАВИ, полученные от животных, естественно переболевших вирусной-диареей-болезнью слизистых, парагриппом-3, респираторной синцитиальной и аденовирусной инфекциями соответственнно (с титром в ИФА не ниже 1:12600).

8. Приготовление нормальной (отрицательной) сыворотки

У животных, прошедших карантин в течение двух месяцев и отрицательно реагирующих в ИФА с антигеном вируса ИРТ, проводят стерильное взятие крови из яремной вены в объеме 300-400 см³ от каждого животного. Кровь выдерживают в термостате при 37°С, затем делают обводку и для отстаивания сыворотки выдерживают 12-14 часов при 4°С. Затем сыворотку отделяют от сгустка крови, осветляют центрифугированием в течение 15 минут при 2,5 тыс. об./мин, инактивируют на водяной бане при 56°С 40 мин. Затем сыворотку консервируют 0,02% азида натрия и разливают по 0,0005 см³ в ампулы.

9. Получение коньюгата антивидового иммунопероксидазного

Антивидовые иммуноглобулины антиIgG КРС, меченные ферментом пероксидазой, готовят в соответствии с «Временной инструкцией по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой», утвержденной ГУВ МСХ СССР 09.12.85, ТУ 46-21-78-85(3), и укомплектовывают набор.

10. Иллюстрация применения тест-системы

10.1. Подготовка биологических компонентов тест-системы

Содержимое каждой ампулы или флакона с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом растворяют в 20 см³ инкубационного буфера, получая рабочую концентрацию конъюгата. Положительные и отрицательные сыворотки во фл. или амп. растворяют в 1 см³ инкубационного буфера, получая разведение 1:200. Растворенные сыворотки и конъюгат можно хранить при температуре 5±1°C в течение 3-4 дней.

10.2. Постановка реакции

Затраты времени на постановку реакции не более 3 часов.

10.2.1.Титрование сывороток

В лунки микропанели (кроме A1, B1, C1 и D1) вносят по 0,1 см³ инкубационного буфера.

В лунки горизонтальных рядов А (кроме A1) и B1 вносят 0,1 см³ исследуемых сывороток, предварительно разведенных 1:100 в инкубационном буфере в отдельных пробирках.

Сыворотки всех рядов титруют методом двукратных разведений, начиная с разведения 1:200 до 1:1600 в объеме 0,1 см³, используя при этом разные пипетки или сменные наконечники к микропипеткам.

Из последних лунок каждого ряда по 0,1 см³ разведения сыворотки удаляют.

Микропанели аккуратно встряхивают, добиваясь тщательного перемешивания полученных разведений сывороток, и инкубируют в термостате 1-1,5 часа при 37°С.

10.2.2. Определение уровня антител при стандартном разведении сывороток 1:200

При эпизоотологическом обследовании поголовья с целью выявления серопозитивных и серонегативных животных сыворотки не титруют, а используют в одном разведении 1:200, но в двух повторностях, используя для каждой сыворотки по 2 лунки плашки. Для этого исследуемые сыворотки разводят в отдельных пробирках 1:200 в инкубационном буфере и вносят попарно в лунки микропанели (кроме A1, B1, C1 и D1), используя сменные наконечники к микропипеткам или отдельные стеклянные пипетки. Панели закрывают крышкой и выдерживают при температуре (37±0,5)°С 1 час.

10.2.3. Внесение коньюгата

Все лунки микропанелей промывают 3 раза по 5 мин инкубационным буфером.

Во все лунки вносят по 0,1 см³ рабочего раствора антивидового коньюгата и инкубируют 1 час при температуре (37±0,5)°С. Промывают 3 раза по 5 мин инкубационным буфером.

10.2.4. Проявление реакции

Готовят субстратный раствор. Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 см³ субстратного раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 10-30 мин.

10.2.5. Остановка реакции

В случае если нет возможности провести учет реакции через 15-30 мин реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 0,05 см³ 1 М серной кислоты.

10.2.6. Учет результатов реакции

Результаты учитывают не позднее 30 минут визуально или спекгрофотометрически.

10.2.6.1. Визуальный учет: при наличии специфических антител ряд лунок с исследуемыми сыворотками имеет оранжево-коричневое окрашивание с разведения сыворотки 1:200, сравнимое с цветом раствора в положительном контроле (лунки C1, D1).

Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля (лунки А1, В1).

10.2.6.2. Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 492 нм. Результаты выражают в единицах оптической плотности.

Положительными считаются пробы, уровень оптической плотности которых, начиная с разведения 1:200 в два и более раза, превосходит уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом не должен быть ниже 0,200 ед.

Сомнительные пробы – это те, уровень оптической плотности которых выше отрицательного контроля и составляет 0,150-0,199 ед.

Уровень оптической плотности ниже 0,150 свидетельствует об отрицательной реакции.

11. Интерпретация результатов ИФА

11.1. Основанием для постановки диагноза является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических и патологоанатомических признаков заболевания.

Заявляемая тест-система была испытана при сравнительном титровании исследуемых сывороток методами РН, РНГА и ИФА для каждой вирусной инфекции соответственно (Таблицы 1-5).

Установлено, что в 86% случаях положительные результаты были получены во всех предложенных методах. Все отрицательные сыворотки в ИФА были отрицательны и в РН, РНГА.

Тест-система повышает чувствительность иммунологической реакции и сокращает время для проведения диагностики и иммуномониторинга указанных выше заболеваний.

Предложенная тест-система найдет применение при обследовании крупного рогатого скота в неблагополучных по респираторным инфекциям хозяйствах.

Высокая чувствительность, специфичность, простота постановки реакции и возможность автоматизации процессов исследования позволяет в короткие сроки проводить массовые обследования поголовья животных.

Источники информации

1. Кочиш Т.Ю. Разработка набора реагентов для определения уровня антител к респираторно-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота в иммуноферментном анализе. Автореф. дис. канд. биол. наук. – Щелково, 2004.

2. Технические условия 19.10.97-89 «Набор для иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», утвержденный ГУВ Госагропрома СССР от 01.08.89 (прототип).

3. Паспорт Всероссийского контрольного института ветеринарных препаратов на штамм ТК-А (ВИЭВ) В2, на штамм ЗКСМ, на штамм «Oregon С24 V», на штамм «Randall» и на штамм «В 10».

4. RU 2306567 G01N 33/535. Способ дифференциальной диагностики вирусных желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа

5. Технические условия 46-21-78-85. «Временная инструкция по изготовлению и контролю антивидовых иммуноглобулинов, меченных ферментом пероксидазой», утвержденная ГУВ МСХ СССР 09.12.85.

7. OIE Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. – 5 hted. – Paris, 2004. – P.142-152.

Формула изобретения

Диагностическая тест-система иммуноферментного анализа для определения уровня антител к вирусным респираторным заболеваниям крупного рогатого скота, характеризующаяся тем, что она содержит 96-луночные микропланшеты, сенсибилизированные аффинно очищенными антигенами вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирусной диареи-болезни слизистых (ВД-БС), парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальной (PC) и аденовирусной (АВИ) инфекций крупного рогатого скота; в качестве положительных контрольных сывороток – вирусспецифическую антиИРТ, вирусспецифическую антиВД-БС, вирусспецифическую антиПГ-3, вирусспецифическую антиРС, вирусспецифическую антиАВИ, и в качестве отрицательных – нативные контрольные сыворотки, конъюгат антивидового иммуноглобулина класса G с пероксидазой, 20-кратный концентрат калийфосфатного буфера, неионный детергент (Твин-20, -80 или Тритон X-305), 10-кратный концентрат субстратного буфера, ортофенилендиамин, перекись водорода и стоп-реагент.