Патент на изобретение №2371720

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БЕСПЛОДИЯ У МУЖЧИН

(57) Реферат:

Изобретение относится к лабораторным методам исследования в области андрологии. Для осуществления способа диагностики бесплодия у мужчин разводят эякулят изотоническим раствором NaCl, наносят каплю фиксатора с взвешенными в нем клетками осадка на предварительно обезжиренный кусочек алюминиевой фольги, инкубируют. После чего промывают фольгу с прикрепившимися клетками с последующей фиксацией в осмиевой кислоте. Заливают в эпоксидную смолу в плоские ванночки с отделением после полимеризации алюминиевой фольги от твердой смолы. Просматривают капсулы под светооптическим микроскопом. Выбирают зафиксированные сперматозоиды для ультраструктурного исследования. Исследуют центриоли и о наличии бесплодия судят по нарушению строения компонентов центриоли – распадению триплетов микротрубочек или нарушению параллельной ориентации триплетов. Использование способа позволяет оценить оплодотворяющую способность сперматозоидов. 3 ил.

Изобретение относится к области исследования биологических материалов, а именно сперматозоидов, и может быть использовано при оценке оплодотворяющей способности сперматозоидов.

Ультраструктурный анализ позволяет выявлять аномалии строения ядра головки сперматозоида, наличие акросомы и аномалии ее строения, атипии строения компонентов жгутика сперматозоида и другие детали патологии сперматозоидов и незрелых половых клеток на разных стадиях развития. Ультраструктурное исследование позволяет проводить диагностику генетически обусловленных и функциональных нарушений оплодотворяющей способности сперматозоидов и может быть использовано в качестве прогностического теста.

Снижение фертильности мужчин вносит свой вклад общую демографическую ситуацию. В последние годы (10-20 лет) в мире ведутся многочисленные исследования репродуктивной функции мужчин. Специалисты различных стран отмечают снижение концентрации сперматозоидов у здоровых мужчин. Так, исследование спермы фертильных доноров в 61 независимом центре показало снижение концентрации сперматозоидов с 1938 по 1990 гг. со 113 до 66 млн/мл. По данным Парижского банка спермы в среднем концентрация сперматозоидов падает на 2,6% в год. Согласно литературным данным последних лет уменьшение концентрации сперматозоидов в группах фертильных мужчин колеблется в различных регионах мира. Так, в Швеции с 1985 по 1995 гг. не выявили ухудшения качества спермы, аналогичные данные получены в некоторых штатах США. Однако детальный анализ данных позволяет считать, что несмотря на неполную сопоставимость и противоречия они описывают объективно протекающий общий процесс снижения сперматогенной функции человека, который может неодинаково проявляться в различных контингентах обследуемых, географических зонах и при действии тех или иных факторов внешней среды. По данным проведенных в 1991-2001 гг. исследований в Москве из 1000 мужчин только 10% имеют подвижность сперматозоидов, соответствующую нормативам ВОЗ.

Бесплодием поражено примерно 15% супружеских пар, и у половины из них основным или сопутствующим фактором является инфертильность мужчин. При этом около 30% всех случаев бесплодия относят к так называемому идиопатическому бесплодию, т.е. бесплодию с невыясненной этиологией. Изучение показателей спермограммы на сегодня остается основным видом обследования мужчин при нарушениях фертильности. Ведущими показателями, отражающими оплодотворяющую способность спермы, полагают концентрацию сперматозоидов (их общее количество), подвижность и содержание сперматозоидов нормальной (типичной) морфологии. Хотя у фертильных мужчин эти показатели в общем выше, тем не менее, в группе фертильных и бесплодных мужчин эти показатели могут значительно перекрываться, позволяя предполагать наличие неких не учитываемых в традиционной диагностике факторов, влияющих на фертильность. Это означает, что, основываясь только на показателях спермиологического обследования, нельзя дать достоверный прогноз фертильности, учитывающий не только возможность зачатия, но и исход наступившей беременности.

Разработка схемы комплексного обследования для проведения дифференциальной диагностики бесплодия является определяющим моментом при выборе адекватных методов терапии. Мужское бесплодие – полиэтиологичное заболевание, для которого до сих пор не существует единой классификации, включающей все многообразие его причин и симптомов. Если не учитывать анатомические и иммунологические причины мужского бесплодия и рассматривать процесс оплодотворения на клеточном уровне, то можно выделить две основные причины неудач оплодотворения:

1. недостаточное количество сперматозоидов или их отсутствие в эякуляте;

2. функциональная неполноценность сперматозоидов.

В первом случае для прогноза фертильности достаточно подсчета концентрации и общего количества сперматозоидов, что выявляют при традиционном лабораторном обследовании эякулята на светооптическом уровне. Нарушение функциональных свойств сперматозоидов при обычном светомикроскопическом исследовании в ряде случаев выявить невозможно. Для определения различных параметров взаимодействия сперматозоидов с яйцеклеткой разработан ряд функциональных тестов. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью (2001 г.) рекомендует проведение так называемых пенетрационных тестов, которые определяют функцию акросомы. Среди таких тестов можно назвать акросомную реакцию, тест связывания сперматозоидов с блестящей оболочкой ооцита (HZA – hemizona assay), тест проникновения сперматозоидов сквозь блестящую оболочку ооцита, тест проникновения сперматозоидов в ооцит, лишенный оболочки. Интенсивно разрабатывают тесты, позволяющие определять целостность ДНК сперматозоида, т.к. доказано, что нарушение целостности и степени конденсации ДНК не только влияет на частоту наступления беременности при естественном зачатии или степень оплодотворения при ЭКО, но приводит к спонтанным абортам или нарушениям развития эмбриона. В ряде исследований показано выраженное различие в содержании сперматозоидов с поврежденной ДНК между группами фертильных и инфертильных мужчин. Степень оплодотворения может быть близка к нулевой, если доля сперматозоидов с повреждением ДНК превышает 30% клеток как при естественном зачатии, так и при внутриматочной инсеминации.

Наряду с вышеупомянутыми тестами для установления этиопатогенеза патозооспермии и для оценки функционального состояния сперматозоидов может быть применен метод ультраструктурного анализа (Брагина Е.Е. и др. Электронно-микроскопическое изучение сперматозоидов и его роль в диагностике мужского бесплодия. «Проблемы репродукции», 2000, 6, стр.62-71). Электронно-микроскопические исследования сперматозоидов позволяют провести качественную и количественную оценку состояния клеточных органоидов, необходимых для выполнения сперматозоидами оплодотворяющей функции:

1) ядра, необходимого для переноса в яйцеклетку генетического материала мужской гаметы;

2) акросомы, с использованием которой осуществляется пенетрация сперматозоидом оболочек яйцеклетки;

3) моторного аппарата – жгутика, с использованием которого преодолевается относительно большое расстояние от влагалища до верхнего отдела яйцевода, где происходит оплодотворение яйцеклетки;

4) базального тельца жгутика – центриоли зрелого сперматозоида, обеспечивающей митотические деления дробления эмбриона.

Исследование ультраструктуры сперматозоидов позволяет выявлять причину их функциональной неполноценности, в ряде случаев дифференцировать генетически обусловленные (например, синдром Картагенера, глобулозооспермия) и индуцированные аномалии, а также позволяет делать прогноз результатов оплодотворения и дальнейшего развития эмбриона при использовании репродуктивных технологий.

Точность анализа, как известно, во многом зависит от способа подготовки образца, в данном случае от способа фиксации сперматозоидов для электронно-микроскопического анализа.

Известен способ (RU, заявка 94036431) дифференциальной диагностики мужской инфертильности при варикоцеле, заключающийся в том, что после воздействия холодом на поясничную область спины измеряют внутримошоночную температуру и по отсутствию градиента температуры или его падению, не превышающему 0,4°С по сравнению с исходной, диагностируют инфертильность, обусловленную варикоцеле, а по значению, превышающему 0,4°С, – мужскую инфертильность иного генеза.

Способ является недостаточно точным, его применение ограничено определением инфертильности только при варикоцеле.

Известен способ (RU, патент 2247371) диагностики мужского бесплодия, включающий исследование эякулята на содержание металлов. При наличии ртути или свинца устанавливают интоксикационную форму бесплодия.

Способ ограничен в применении и позволяет диагностировать только интоксикационную форму бесплодия.

Известен (Урбанский А.С., Чекушин Р.Х., Медведева Н.Л., Громов К.Г. Методические рекомендации для врачей “Комплексная медико-социальная реабилитация репродуктивной функции мужчин, перенесших урогенитальные инфекции на этапе планирования семьи”, Кемерово, 2005. – С.13-15) способ исследования эякулята, полученного от пациента путем мастурбации после 3-4-дневного воздержания. Исследование начинают спустя 30 минут после сбора эякулята. Проводят микроскопическое исследование: оценка объема, вязкости, запаха, цвета, реакции (рН). Микроскопическое исследование определяет количество, качество и подвижность сперматозоидов. Для микроскопического исследования используют бинокулярный микроскоп МС-50 (micros Austria), с увеличением до 1600х, ахромат объективы (4х, 10х, 40х, 100х). Исследование проводят при комнатной температуре (не ниже +20°С). Для обзорной микроскопии используют нативный препарат, приготовленный из свежего эякулята. Для подсчета процента подвижных и неподвижных форм используют камеру Горяева с физиологическим раствором, а также разводящей жидкостью А.А.Рубенкова для подсчета общего числа сперматозоидов. Способ позволяет определить количество подвижных сперматозоидов и диагностировать бесплодие мужчины.

Недостатком способа является то, что определение количества подвижных сперматозоидов позволяет диагностировать бесплодие, но не позволяет прогнозировать эффективность лечения бесплодия.

Известен способ обработки эякулята для электронно-микроскопического исследования (Брагина Е.Е., Абдумаликов Р.А. Руководство по сперматологии. М., 2002, с. 85). Согласно известному способу эякулят после разжижения переливают в центрифужную пробирку. К эякуляту добавляют фиксатор – 2,5% раствор глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном или какодилатном буфере (рН 7,2-7,4), центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 2 мл фиксатора, затем ресуспендируют. Суспензию центрифугируют, сливают супернатант, наливают буфер и инкубируют с последующим центрифугированием. Сливают надосадочную жидкость, фиксируют клетки 1%-ным раствором четырехокиси осмия на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4). Фиксируют 1-1,5 час при 4°С в плотно закрытой пробирке, избегая прямого света. Сливают осмиевый фиксатор и приливают этанол. Процедуру повторяют 2-3 раза, пока сливаемый 50%-ный этанол не перестанет темнеть. Инкубируют в закрытой пробирке 12-14 час (обычно в этом растворе материал оставляют на ночь) при +4°С, избегая прямого света. Проводят дегидратацию материала в спиртах возрастающей концентрации (96%-ный этанол – 30 мин, 100%-ный этанол – 2 смены по 30 мин) и абсолютном ацетоне или окиси пропилена – 30 мин. Дегидратацию проводят в закрытом сосуде. Проводят предварительную пропитку материала в 3-х смесях абсолютного ацетона или окиси пропилена с эпоксидной смолой. Для первой смеси смешать 1 часть эпоксидной смолы и 2 части ацетона или окиси пропилена, для второй – 1 часть смолы и 1 часть растворителя, для третьей – 2 части смолы и 1 часть растворителя. Смесь наливают в формочку, которую помещают в плотно закрытую посуду. В каждой смеси материал инкубируют по 1 часу при 20°С. Наливают в формочку жидкую эпоксидную смолу, полимеризацию проводят 24 час при температуре 37°С и 24 час – при температуре 56°С. Полученную пластину из эпоксидной смолы, на поверхности которой находятся сперматозоиды, режут с использованием специально изготовленных стеклянных или алмазных ножей на ультрамикротоме, полученные ультратонкие срезы контрастируют цитратом свинца, после чего они пригодны для изучения в электронном микроскопе. Изучение сперматозоидов оптимально производить при увеличении 5000х (общий просмотр) и 16000х-18000х (исследование органоидов). Для определения аномалий тонкого строения жгутиков срезы следует изучать при увеличении 20000х-25000х.

В результате на срезах изучаются случайно ориентированные сперматозоиды, что затрудняет оценку ультраструктуры имеющих полярное расположение органоидов (аксонемы, акросомы, центриоли).

Техническая задача, решаемая посредством разработанного изобретения, состоит в обеспечении установления этиопатогенеза патозооспермии и оценки функционального состояния сперматозоидов.

Технический результат, получаемый при реализации разработанного изобретения, состоит в повышении точности установления причин диагностики бесплодия.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать способ диагностики бесплодия у мужчин. Разработанный способ включает фиксацию с использованием разведения экулята изотоническим раствором NaCl (физиологическим раствором), взятым в соотношении 1:20, центрифугирование, удаление супернатанта, добавление свежего фиксатора, повторное центрифугирование, удаление супернатанта, добавление 0,1 мл фиксатора, диспергирование осадка, нанесение капли фиксатора с взвешенными в нем клетками осадка на предварительно обезжиренный кусочек алюминиевой фольги, инкубацию во влажной камере при комнатной температуре 30 мин, промывку фольги с прикрепившимися клетками в 0,1М буферном растворе с последующей фиксацией в осмиевой кислоте, обезвоживанием, заливкой в эпоксидную смолу в плоские ванночки, отделением после полимеризации алюминиевой фольги от твердой смолы и просмотром плоских капсул под светооптическим микроскопом, выбор зафиксированных сперматозоидов для ультраструктурного исследования и последующего ультраструктурного исследования центриолей. Нормальная центриоль представляет собой цилиндр диаметром около 0,2 мкм, построенный из 9 триплетов микротрубочек, расположенных по периферии цилиндра (фиг.1). Микротрубочки в каждом триплете соединены между собой. Нарушение строения центриоли может выражаться в распадении триплетов на отдельные составляющие его микротрубочки (фиг.2) или в нарушении параллельного расположения триплетов (фиг.3).

Центриоли у человека и других крупных млекопитающих наследуются по отцовской линии, т.е. центриоль оплодотворенной яйцеклетки (зиготы) происходит из центриоли сперматозоида. Центриоль сперматозоида является основой построения «спермальной звезды» и центром митотического деления зиготы. Аномалии строения центриоли приводят к нарушению митотических делений и остановке развития эмбриона на ранних стадиях.

В качестве фиксатора предпочтительно используют глутаровый альдегид. Для получения раствора фиксатора 90 мл 0,1 М фосфатного или какодилатного буфера смешивают с 10 мл исходного 25%-ного раствора глутарового альдегида. Для приготовления фиксатора можно использовать только глутаровый альдегид, предназначенный для электронно-микроскопического исследования (фирмы Merk, Serva и др.).

Способ реализуют следующим образом.

Эякулят, полученный путем мастурбации, помещают в термостат (37°С) на 15-30 мин для разжижения. Эякулят после разжижения переливают в центрифужную пробирку. К эякуляту добавляют изотонический раствор NaCl (физиологический раствор) в соотношении 1:20 и 0,1 мл фиксатора – 2,5%-ного раствора глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном или какодилатном буфере (рН 7,2-7,4), центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость, к осадку добавляют 2 мл фиксатора, затем ресуспендируют и инкубируют при 4°С в течение 60 мин. Полученный зафиксированный материал при необходимости можно хранить в плотно закрытой пробирке при 4°С до 30 суток. Суспензию центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин, сливают супернатант, наливают 0,3 мл фиксатора, ресуспендируют, помещают на кусочек предварительно обезжиренной (2-3 суток в 96%-ном этаноле) алюминиевой фольги и инкубируют при комнатной температуре во влажной камере 30 мин. Фольгу с прикрепившимися клетками помещают в пробирку с буфером (применяют буфер, использованный для разведения фиксатора) и инкубируют при 4°С в течение 15 мин. Сливают буфер, фиксируют клетки 1%-ным раствором четырехокиси осмия на 0,1М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4). Раствор готовят ех tempore из исходного 2%-ного водного раствора четырехокиси осмия. Фиксируют 1-1,5 час при 4°С в плотно закрытой пробирке, избегая прямого света. Сливают осмиевый фиксатор, помещают фольгу с клетками в 50%-ный этанол. Процедуру повторяют 2-3 раза, пока сливаемый 50%-ный этанол не перестанет темнеть. Оставляют фольгу в последней порции этанола на 5 мин. Помещают фольгу с клетками в насыщенный раствор уранилацетата в 70%-ном этаноле. Инкубируют в закрытой пробирке 12-14 час (обычно в этом растворе материал оставляют на ночь) при+4°С, избегая прямого света. Проводят дегидратацию материала в спиртах возрастающей концентрации (96%-ный этанол – 30 мин, 100%-ный этанол – 2 смены по 30 мин) и абсолютном ацетоне или окиси пропилена – 30 мин. Дегидратацию проводят в закрытом сосуде. Проводят предварительную пропитку материала в 3-х смесях абсолютного ацетона или окиси пропилена с эпоксидной смолой. Для первой смеси смешать 1 часть эпоксидной смолы и 2 части ацетона или окиси пропилена, для второй – 1 часть смолы и 1 часть растворителя, для третьей – 2 части смолы и 1 часть растворителя. Смесь наливают в формочку, которую помещают в плотно закрытую посуду. В каждой смеси материал инкубируют по 1 часу при 20°С. Наливают в формочку жидкую эпоксидную смолу, полимеризацию проводят 24 час при температуре 37°С и 24 час – при температуре 56°С. Полученную пластину из эпоксидной смолы, на поверхности которой находятся сперматозоиды, освобождают от металлической фольги. В светооптическом микроскопе выбирают сперматозоиды для изучения и готовят срезы с использованием стеклянных или алмазных ножей на ультрамикротоме, полученные ультратонкие срезы контрастируют цитратом свинца, после чего они пригодны для изучения в электронном микроскопе. Изучение сперматозоидов оптимально производить при увеличении 5000х (общий просмотр) и 16000х-18000х (исследование органоидов). Для определения аномалий тонкого строения жгутиков срезы следует изучать при увеличении 20000х-25000х.

Электронно-микроскопическое изучение сперматозоидов позволяет оценить структурную целостность и, следовательно, функциональную адекватность субклеточных структур, ответственных за осуществление клеточного движения, пенетрирующей и оплодотворяющей способности сперматозоидов. Метод ультраструктурного исследования помогает выявить связь между нормальными показателями спермиологического обследования и длительным, связанным с мужским фактором, бесплодием (так называемое идиопатическое бесплодие). Только электронно-микроскопический анализ информативен у пациентов с астенозооспермией при “нормальных” морфологических характеристиках сперматозоидов при рутинном светооптическом изучении для выявлении аномалий жгутика (особенно аксонемы или митохондрий). У пациентов с аномалиями строения хроматина (незрелый хроматин) и акросомы ультраструктурный анализ может быть использован вместо/вместе с другими функциональными тестами.

Исследование ультраструктуры центриоли сперматозоида позволяет прогнозировать качество полученного эмбриона. При аномальном строении центриоли сперматозоида (фиг.2, 3) развитие эмбриона останавливается на стадии бластулы. В случае генетически обусловленной аномалии строения центриолей дается неблагоприятный прогноз исхода оплодотворения.

Проведение в этих случаях ультраструктурного анализа для исключения возможности генетически обусловленной патологии имеет прогностическое значение при выборе методов терапии или вспомогательной репродукции. Ультраструктурный анализ может быть использован в качестве функционального теста для прогнозирования исхода оплодотворения (особенно в случаях экстракорпорального оплодотворения).

Формула изобретения

Способ диагностики бесплодия у мужчин, характеризуемый фиксацией, с использованием разведения эякулята изотоническим раствором NaCl, взятым в соотношении 1:20, с нанесением капли фиксатора с взвешенными в нем клетками осадка на предварительно обезжиренный кусочек алюминиевой фольги, инкубацию во влажной камере при комнатной температуре 30 мин, промывку фольги с прикрепившимися клетками в 0,1 М фосфатном буферном растворе рН 7,2-7,4 с последующей фиксацией в осмиевой кислоте, обезвоживанием, заливкой в эпоксидную смолу в плоские ванночки, отделением после полимеризации алюминиевой фольги от твердой смолы, просмотром плоских капсул под светооптическим микроскопом, выбором зафиксированных сперматозоидов для ультраструктурного исследования и исследованием центриолей, причем о наличии бесплодия судят по нарушению строения компонентов центриоли – распадение триплетов микротрубочек или нарушению параллельной ориентации триплетов.

РИСУНКИ