Патент на изобретение №2371477
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ЯДЕР ИЗ ПЫЛЬНИКОВ ПШЕНИЦЫ
(57) Реферат:
Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и представляет собой способ выделения клеточных ядер из пыльников пшеницы. Способ включает консервацию изолированных пыльников при температуре минус 25°С в присутствии 80-90% глицерина, гомогенизацию раздавливанием в яшмовой ступке в среде гомогенизации, фильтрование, высокоскоростное центрифугирование, очистку в градиенте плотности глицерина 50, 60, 70, 80, 90 мас./объем и снятие клеточных оболочек 1% тритоном Х-100. Изобретение позволяет повысить выход очищенных клеточных ядер из репродуктивных органов и тканей растений с одновременным сохранением их нативности. 2 табл.
Изобретение относится к физиологии и биохимии растений и может быть применено к анализу механизмов генеративного этапа морфогенеза пыльника пшеницы, а именно при исследовании взаимосвязи надмолекулярных структур клеточных ядер в течение развертывания генетических программ развития, что необходимо для получения дополнительной информации в разработках и построении компьютерных моделей организации генных и эпигенных сетей управления. Известен способ выделения растительных клеточных ядер [1], в котором был описан способ изоляции клеточных ядер из соматических клеток растений. Недостаток этого метода заключается в том, что в процессе изоляции клеточных ядер из генеративных органов и тканей растений наблюдается низкий выход нативных клеточных ядер. Вышеуказанный способ выделения растительных клеточных ядер был принят за основу, в котором первоначально производят консервацию растительных тканей в 80-90% глицерине с последующей трехступенчатой гомогенизацией в забуференной 20% глицериновой среде, низкоскоростное центрифугирование растительного гомогената и очистку ядер через пятислойный (50, 60, 70, 80, 90 мас./объем) забуференный глицериновый градиент. Недостатком этого способа является то, что при трехступенчатой гомогенизации происходит большая потеря клеточных ядер из генеративных органов и тканей растений, при низкоскоростном центрифугировании не происходит их осаждения, т.к. в гомогенате в основном содержатся репродуктивные клетки, оболочки которых не снимаются 0,5% тритоном Х-100. Цель изобретения – повышение выхода очищенных клеточных ядер из репродуктивных органов и тканей растений с одновременным сохранением их нативности. Указанная цель достигается тем, что в способе выделения клеточных ядер из пыльников пшеницы из консервированных пыльников пшеницы в глицериновой среде первоначально выделяют репродуктивные клетки путем раздавливания пыльников в яшмовой ступке, высокоскоростном центрифугировании гомогената для осаждения репродуктивных клеток, с последующей их очисткой через пятислойный глицериновый градиент и промывкой 1% тритоном Х-100 для снятия клеточных оболочек. Изобретение иллюстрируется следующим примером. Пример. Опыты проводили на пыльниках пшениц сортов Московская 35 и Фотос на стадиях микроскпороцита, невакуолизированной, слабо- и сильновакуолизированной микроспоры, двухклеточного и трехклеточного пыльцевого зерна. Пшеница выращивалась в полевых условиях, стадии созревания пыльника контролировались цитологически. Изолированные пыльники консервировали в 80-90% глицерине при температуре -25°С. Затем заливали гомогенизационной средой: 20% глицерин, 0.02 М триэтаноламин (ТЭА)·НСl рН 6.8; 0.005 М MgCl2; 0.025 М KCl; 0.003 CaCl2; 0.005 M NaCl; 0.004 М n-октиловый спирт и 0.004 М Степень чистоты выделенных препаратов клеточных ядер определяли микроскопически, спектрофотометрически и по компонентному составу клеточных ядер (белок/ДНК, РНК/ДНК) (табл.1). Количество белка определяли по связыванию белка с кумасси ярко-синим G (Loba, Австрия) [2, 3]. Метод использовался в случае микронаноколичественного определения белка. Для определения ДНК и РНК использовали метод А.С.Спирина [4]. Протеолитическую активность в препаратах клеточных ядер и ядерных фракциях определяли по методу [2]. Анализ таблицы 2 показал, что процентный выход нативных клеточных ядер с сохраненной ферментативной системой предложенным способом приблизительной в 10 раз выше по сравнению со способом, известным ранее. Данное изобретение рекомендуется для молекулярно-генетического анализа репродуктивных органов и тканей растений. Источники информация
3. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. С.342.
Формула изобретения
Способ выделения клеточных ядер из пыльников пшеницы, включающий консервацию изолированных пыльников при температуре минус 25°С в присутствии 80-90% глицерина, гомогенизацию раздавливанием в яшмовой ступке в среде гомогенизации, фильтрование, высокоскоростное центрифугирование, очистку в градиенте плотности глицерина 50, 60, 70, 80, 90 мас./об. и снятие клеточных оболочек 1%-ным тритоном Х-100.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
-меркаптоэтанол. Гомогенат получали путем раздавливания растительного материала в яшмовой ступке в течение 60 с, который фильтровали через 4 слоя капрона размером пор 70 мкм с последующим центрифугированием при 15000 об/мин (К-24, ГДР) в течение 15 мин с целью осаждения генеративных клеток, затем осадок собирали суспендированием в среде гомогенизации (1,5 мл) и наслаивали на прерывистый глицериновый градиент, состоящий из 5 слоев (по 0,5 мл) возрастающей концентрации глицерина (50%, 60%, 70%, 80%, 90% вес./объем) приготовленном на ТЭА-НСl рН 6,8 буфере со всеми вышеперечисленными компонентами гомогенизационной среды, исключая 20% глицерин. Градиентное центрифугирование проводили при 2500 об/мин в течение часа (К-23, ГДР). Осадок клеток промывали 1% тритоном Х-100 на среде гомогенизации, но без глицерина, с последующим центрифугированием при 2700 об/мин (К-23, ГДР) в течение 15 мин для снятия клеточной оболочки, после чего полученные ядра промывали дважды в среде следующего состава: 0.005 М MgCl2; 0.025 М KCl; 0.003 CaCl2; 0.005 M NaCl; 0,01 М трис-HCl рН 6.8 с последующим центрифугированием при вышеуказанных условиях.
48. С.98.