Патент на изобретение №2371167

(54) ПРИМЕНЕНИЕ ПЕПТИДОВ XIKVAV В ИЗГОТОВЛЕНИИ КОСМЕТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЙ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПЛОТНОСТИ КОЖИ ЗА СЧЕТ УСИЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ

(57) Реферат:

Изобретение относится к применению пептидов, имеющих общую формулу Х-изолейцил-лизил-валил-аланил-валин-Y, известных как XIKVAV (Фиг.1), где X выбран из группы, образованной водородом, аминокислотой или ацильной группой, a Y выбран из группы, образованной амино, гидроксилом или тиолом, которые стимулируют биоадгезию кожных клеток путем повышения экспрессии биоадгезивных пептидов. Изобретение также относится к применению пептидов XIKVAV в изготовлении косметических композиций, а также к самим косметическим композициям, предназначенным для повышения плотности кожи. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 10 ил.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к косметическим композициям, предназначенным для повышения плотности кожи за счет усиления адгезии кожных клеток друг к другу и к базальной мембране. Вышеуказанные композиции содержат косметически эффективное количество пептидов формулы I, имеющих общую формулу Х-изолейцил-лизил-валил-аланил-валин-Y (ниже называемых как XIKVAV), где Х может представлять собой Н, аминокислоту или ацильную группу с прямой или разветвленной цепью (см. Фиг.1), a Y может представлять собой амино, гидроксил или тиол, каждый из которых незамещен или замещен жирными кислотами:

Предшествующий уровень техники

Кожа является самым большим органом человеческого организма. Можно различить два слоя: эпидермис и дерму. Эти два слоя соединены через базальную мембрану, матрикс, образованный разными макромолекулами (коллагеном, ламинином, протеогликанами и т.д.).

Базальная мембрана богата коллагеном IV типа, протеогликанами и гликопротеинами энтактином и ламинином.

Эти молекулы обеспечивают структурную сеть, а также биоадгезивные свойства, необходимые для связывания клеток. Последовательность ламинина содержит несколько доменов связывания: для коллагена IV типа, для перлекана (гепаринсульфат протеогликан), для энтактина и для рецепторов в клеточной поверхности.

Эта базальная мембрана представляет собой специфический внеклеточный матрикс, образованный тремя слоями:

– Lamina lucida (светлая пластинка): этот слой находится в непосредственном контакте с базальными кератиноцитами, и его основным компонентом является ламинин.

– Lamina densa (плотная пластинка): расположена под светлой пластинкой и простирается параллельно последней с аналогичной толщиной. Представляет собой аморфное вещество, в котором преобладает коллаген IV, ответственное за большую силу сцепления и эластичность базальной мембраны.

– Reticular lamina (ретикулярная пластинка): находится под предыдущими слоями, но ее расположение является менее точным, и она образована фибробластами дермы. Она образована фиксирующими фибриллами и эластичными микрофибриллами, которые внедрены в плотный слой, вместе с которым они поддерживают базальную мембрану и обеспечивают сцепление с кожной тканью. Фиксирующие фибриллы представляют собой структуры, образованные коллагеном VII.

Ламинин обнаружен в первой из упомянутых пластинок, светлой пластинке, и является его основным компонентом.

Ламинин представляет собой гликопротеин массой примерно 850 кДа, и является, после коллагена, самым часто встречающимся белком во внеклеточном матриксе (ЕСМ). Ламинин обнаружен исключительно в базальных мембранах и образован тремя длинными полипептидными цепями (альфа, бета и гамма), рассосредоченными перекрестным образом и соединенными дисульфидными мостиками.

Эти три цепи существуют в разных подтипах ламинина, и результатом их комбинаций являются двенадцать разных изоформ ламинина, среди которых наиболее изученным является ламинин-1.

Интегрины являются самыми важными из рецепторов, вовлеченных в распознавание ламинина, и они являются первыми обнаруженными рецепторами ЕСМ. Они представляют собой группу трансмембранных рецепторов клеточной поверхности, ответственных за взаимодействие клетка-клетка и клетка-ЕСМ.

Клетки распознают связывающие домены в ламинине через рецепторные интегрины, в результате чего происходит связывание последних с базальной мембраной, богатой ламининами. Рецепторные интегрины также опосредуют связывание между клетками посредством специфических лигандов.

Старение кожи является одним из кожных процессов, происходящих в коже, и является общим биологическим процессом для всех живых организмов.

Когда происходит процесс старения кожи, как правило, наблюдается потеря функциональных возможностей кожи и повышение ее уязвимости, характеризующееся сухой, морщинистой, желтоватой кожей с пятнами, сероватыми волосками, а также вялостью и снижением тонуса ткани и т.д.

Сделано наблюдение, что адгезия клеток эпидермиса к базальной мембране начинает ослабевать после 30 лет. Это ослабление контакта между дермой и эпидермисом приводит к структурным и функциональным изменениям в коже, которые составляют часть процесса старения [J. Investig. Dermatol. Symp. Рrос. 1998; 3 (2): 172-9].

Следовательно, возможно предупредить и предотвратить снижение тонуса и недостаточную плотность кожи посредством усиления адгезии между клетками и базальной мембраной, замедляя, таким образом, старение кожи.

В этом смысле изобретения, относящиеся к применению пептидов общей формулы XIKVAV в косметических композициях для повышения плотности кожи и замедления ее старения до сих пор не были описаны в уровне техники.

Патент США 5744515 [Method and implantable article for promoting endothelialization] относится к имплантатам, изготовленным из полимерных, керамических и металлических материалов с поверхностью, покрытой адгезивными молекулами, такими как фибронектин, ламинин, коллаген и их домены. SIKVAV является одним из доменов, описанным среди этих доменов, и конкретно описан как домен белка фибронектина. Адгезивные молекулы включены, чтобы стимулировать эндотелиализацию имплантата и его адгезию к клеткам, а имплантат изготовлен из пористого биологического материала, чтобы обеспечить возможность роста капилляров через этот материал.

С другой стороны, патент США 6428579 [Implantable prosthetic devices coated with bioactive molecules} относится к имплантату, покрытому золотом, на которое прикреплены биологически активные пептиды с разными типами свойств, такие как клеточно-модулирующие, хемотаксические, антикоагулянтные, антитромботические, противоопухолевые, противоинфекционные, усиливающие рост, противовоспалительные свойства и т.д. SIXVAV, среди прочего, упомянут в качестве примера пептида, клеточно-модулирующего пептида в рамках группы пептидов, связывающих интегрин. Предпочтительным применением этих имплантатов является ускорение костного роста после травматической операции, и пептиды, являющиеся субстратами интегринов, например, SIKVAV, используются для улучшения адгезии пептидов к костной ткани.

Патент США 6673108 [Transmural concentric multilayer ingrowth matrix within well-defined porosity] относится к матриксу с некоторыми синтетическими или белковоподобными слоями. Каждый слой имеет специфическую функцию. Фибриновый слой, модифицированный пептидами или факторами роста, и конкретно фибриновый слой с пептидами, происходящими от ламинина, такими как SIKVAV, упомянуты в качестве примера белковоподобных слоев.

Ни в одном из этих патентов не упомянуто применение пептидов общей формулы XIKVAV в косметических композициях.

Следовательно, основой настоящего изобретения является предложение косметической композиции, способной повышать плотность кожи, замедляя, таким образом, ее старение.

Описание изобретения

Пептиды общей формулы XIKVAV образуют хемотаксический участок в ламинине, то есть участок привлечения клеток. Это является причиной того, что эти пептиды стимулируют адгезию, рост и миграцию клеток, с регенерацией, таким образом, базальной мембраны. Свойства стимуляции ангиогенеза (образования новых кровеносных сосудов), что способствует пролиферации и дифференциации эндотелиальных клеток, также известны для этих пептидов [Journal of Cellular Physiol. 1992 Dec; 153(3): 614-25].

Взаимодействия между пептидами формы XIKVAV и рецепторными интегринами известны, и их применение описано в патенте ЕР 1325739 [“Liposomes encapsulating anticancer drugs and the use thereof in the treatment of malignant tumors”], где сверхэкспрессию рецепторов ламинина в мембранах опухолевых клеток используют для направления к последним покрытых пептидами XIKVAV липосом, содержащих противоопухолевые агенты.

Теперь было определено, что пептиды XIKVAV имеют разные функции для косметического применения на уровне кожных клеток, которые описаны ниже:

– Стимуляция адгезии кератиноцитов (см. Фиг.8) в присутствии пептидов XIKVAV, таких как IKVAV, SIKVAV или PaI-IKVAV, где Х представляет собой Н, радикал серил или пальмитоил соответственно.

– Стимуляция экспрессии 6-интегрина в фибробластах, как наблюдается на Фиг.3, при которой наблюдается появление флуоресценции в присутствии XIKVAV, когда экспрессируется 6-интегрин, в противоположность Фиг.2, на которой показано, что происходит в контрольном образце, в который не добавлен XIKVAV.

– Стимуляцию экспрессии ламинина V в фибробластах наблюдают по появлению флуоресценции, как видно на Фиг.5, в присутствии пептидов XIKVAV. Контрольный образец без пептидов XIKVAV используют для наблюдения эффекта экспрессии ламинина V (см. Фиг.4).

В настоящем изобретении разработана косметическая композиция, включающая пептиды общей формулы XIKVAV, способная повышать плотность кожи, замедляя, таким образом, ее старение.

Были проведены анализы для количественного определения усиления клеточной адгезии кератиноцитов и фибробластов, а также образование интегринов, ламининов и т.д.

Итак, пептиды XIKVAV могут способствовать адгезии кератиноцитов сами по себе и стимулируя синтез фибробластами ламинина V и 6-интегрина (биоадгезиваные пептиды), оба из которых связаны с гемидесмосомами, являющимися существенными структурами для дермально-эпидермального связывания.

Также вышеупомянутая стимуляция микроциркуляции вместе с хорошим состоянием базальной мембраны будут способствовать надлежащему транспорту кислорода и метаболитов, а также элиминации продуктов выделения, улучшая, таким образом, функциональную способность клеток эпидермиса и в то же время их сопротивляемость и плотность.

Таким образом, применение пептидов XIKVAV, включенных в косметическую композицию для местного применения, оказывает непосредственное воздействие на предупреждение старения кожи, замедление потери контакта между дермой и эпидермисом и предупреждение структурных и функциональных изменений, составляющих часть процесса старения.

Таким образом, согласно первому аспекту, изобретение относится к применению пептидов общей формулы XIKVAV (см. Фиг.1), где Х выбран из группы, образованной Н, аминокислотой или ацильной группой с прямой или разветвленной цепью, a Y может представлять собой амино, гидроксил или тиол, каждый из которых незамещен или замещен жирными кислотами, для стимуляции биоадгезии кожных клеток путем повышения экспрессии биоадгезивных пептидов.

Предпочтительно в пептидах общей формулы XIKVAV, X представляет собой водород, серин, пальмитоил или деканоил, и Y может представлять собой амино, гидроксил или тиол, каждый из которых незамещен или замещен жирными кислотами.

Предпочтительно в пептидах общей формулы XIKVAV, X представляет собой серин, а Y представляет собой гидроксил, то есть пептид SIKVAV.

Предпочтительно в пептидах общей формулы XIKVAV, X представляет собой водород, а Y представляет собой гидроксил, то есть пептид IKVAV.

Предпочтительно кожные клетки, в которых стимулируют биоадгезию, представляют собой кератиноциты, а биоадгезивные пептиды представляют собой 6-интегрин и ламинин V.

Согласно второму аспекту изобретение относится к косметической композиции, содержащей в косметически приемлемой среде косметически эффективное количество пептидов, имеющих общую формулу XIKVAV, для стимуляции биоадгезии кожных клеток путем повышения экспрессии биоадгезивных пептидов.

Указанная композиция предпочтительно предназначена для кожного применения.

Согласно предпочтительному воплощению, указанная композиция повышает плотность кожи, и этот эффект вызван усилением адгезии кожных клеток друг к другу и к базальной мембране.

В настоящем изобретении пептиды XIKVAV (см. Фиг.1) предпочтительно включены в косметическую композицию в концентрации вплоть до 12%.

В настоящем изобретении пептиды XIKVAV (см. Фиг.1) предпочтительно включены в косметическую композицию в концентрации предпочтительно 5%.

Предпочтительными являются эксципиенты, традиционно используемые в косметике: вода, спирты, лецитины, природные или искусственные полимеры, сурфактанты и поверхностно активные агенты, консерванты и т.д.

Предпочтительными являются традиционно используемые косметические формы: кремы, лосьоны, эмульсии, шампуни, сыворотки, гели и т.д.

Согласно предпочтительному воплощению композиция содержит следующие ингредиенты в следующих процентных отношениях по массе:

ИНГРЕДИЕНТ	%
XIKVAV	0,001-10
Вазелин	0-10
Триэтаноламин	0-10
ВНТ (бутилированный гидрокситолуол)	0-10
Феноксиэтанол,
Метилпарабен,	0-10
Бутилпарабен,
Этилпарабен,
Пропилпарабен,
Изобутилпарабен
Стеариновая кислота	0-10
Пчелиный воск	0-10
Карбомер	0-10
Диметиконол	0-10
Циклометикон	0-1
Глицерин	0-10
Цетилстеариновый спирт	0-10
Отдушка	0-10
Вода	До 100

Другие активные ингредиенты, используемые как часть косметической композиции, могут представлять собой витамины, натуральные экстракты, ферменты и другие традиционные ингредиенты для различных применений косметических препаратов: ингредиенты против старения, антицеллюлитные, увлажняющие, регенерирующие, восстанавливающие ингредиенты и т.д.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению пептидов общей формулы XIKVAV в изготовлении косметической композиции, повышающей плотность кожи.

Поскольку клетки используют интегрины для распознавания ламининов, а ламинины связывают клетки через интегрины, косметическая композиция по настоящему изобретению будет усиливать адгезию клеток и их связывание с базальной мембраной, так как пептиды XIKVAV способны повышать продуцирование интегринов и ламининов и совместимы в отношении возможности их использования в качестве ингредиентов в косметической композиции.

Как будет отражено ниже в примерах, были проведены анализы, в которых наблюдался эффект адгезии в клетках кожи, полученный благодаря присутствию пептидов общей формулы XIKVAV, а также повышение клеточной пролиферации.

Таким образом, такое повышение клеточной пролиферации вместе с эффектом адгезии, полученном при использовании пептидов общей формулы XIKVAV, обеспечивает возможность получения более компактного эпидермиса, предупреждая недостаточную плотность, которая очень характерна для старения кожи.

Другим характерным признаком стареющей кожи является потеря контакта между клетками, являющаяся причиной для недостаточности питания и таких изменений в коже как сухость, желтоватый цвет и потеря функциональности.

С этими признаками старения можно бороться, используя косметическую композицию, разработанную согласно настоящему изобретению, включающую пептиды общей формулы XIKVAV.

Воплощения

Эксперименты, изложенные ниже, описаны как подтверждение конкретных аспектов настоящего изобретения и ни в коем случае не ограничивают его объем.

Пример 1:

Анализы окрашивания с использованием иммунной метки были проведены на фибробластах и кератиноцитах человека, чтобы определить, обладает ли SIKVAV способностью усиливать экспрессию 6-интегрина и ламинина V (Фиг.3, 4, 5 и 6, 2, 3, 4 и 5).

С учетом того, что клетки используют интегрины для распознавания ламининов, а ламинины связывают клетки с базальной мембраной через интегрины, пептид, который способен повышать продуцирование интегринов и ламининов, будет усиливать адгезию клеток и их связывание с базальной мембраной.

В данном анализе используют первое (моноклональное) антитело, связывающееся с белком, который предназначен для обнаружения (интегрин или ламинин), и второе (поликлональное) антитело, связывающееся с комплексом между белком и первым антителом. Второе антитело соединено с флуоресцирующим соединением (FITC – флуоресцеина изотиоцианат).

FITC возбуждают пропущенным через светофильтр светом с длиной волны 495 нм (длина волны поглощения), и свет, испускаемый этим красителем, обнаруживают при 528 нм (длина волны испускания).

Эти аспекты можно увидеть на Фиг.2, 3, 4 и 5.

Экспрессию 6-интегрина в фибробластах человека, которые не были обработаны SIKVAV, можно наблюдать по иммунофлуоресцентной эмиссии на Фиг.2. С другой стороны, повышение экспрессии 6-интегрина в фибробластах человека, обработанных SIKVAV, можно также видеть по иммунофлуоресцентной эмиссии на Фиг.3.

Различие в экспрессии ламинина в присутствии и в отсутствие SIKVAV определяли в таком же анализе.

Это различие в экспрессии можно наблюдать на Фиг.4 и 5. Экспрессию ламинина V в фибробластах человека, которые не были обработаны SIKVAV, можно наблюдать по иммунофлуоресценции на Фиг.4, и повышение экспрессии ламинина V в фибробластах человека, обработанных SIKVAV, можно также видеть по эмиссии иммунофлуоресценции на Фиг.5.

В заключение, значительное повышение экспрессии ламинина V и 6-интегрина можно наблюдать в фибробластах, обработанных SIKVAV, но не в кератиноцитах. Не обнаружено какого-либо варьирования в продуцировании интегрина бета-1.

Пример 2:

Процесс адгезии на клеточном уровне определяли посредством in vitro культуры фибробластов в анализе второго воплощения.

Эти данные представлены на Фиг.6 и 7.

На Фиг.6 показана клеточная адгезия в необработанных фибробластах человека, а на Фиг.7 показана клеточная адгезия в фибробластах, обработанных SIKVAV.

На Фиг.6 и 7 показано однородное покрытие аналитических микролунок и рост и распределение фибробластов, которые в большей степени связаны с адгезией клеток, чем с пролиферацией клеток.

В дополнение к стимуляции адгезии и миграции клеток, косметический препарат с SIKVAV способствует образованию кровеносных сосудов, улучшая микроциркуляцию.

Пример 3:

В данном воплощении показана in vitro оценка клеточной адгезии кератиноцитов к пептидам общей формулы XIKVAV и их сравнительная оценка.

В данном воплощении показано, как адгезия кожных клеток усиливается в присутствии пептидов XIKVAV, и сравнение различных вариантов этих пептидов: SIKVAV, IKVAV, PaI-IKVAV, SIKVAV-OH и SIKVAV-NH₂ (см. Фиг.8, 9 и 10).

Клеточные культуры, использованные в приведенном ниже примере, представляют собой кератиноциты эпидермиса человека (НЕКа) в присутствии специфических факторов роста кератиноцитов.

Сначала 96 микролунок помещают в планшет, покрывают их 50 мкл пептида общей формулы XIKVAV (0,5-250 мкг/мл на микролунку) в дистиллированной воде и высушивают в течение ночи при комнатной температуре.

С другой стороны, для оценки неспецифической клеточной адгезии, проводят контрольные анализы с микролунками, покрытыми 40 мкМ BSA (бычьего сывороточного альбумина).

Все микролунки промывали 200 мкл PBS (фосфатно-солевого буферного раствора) и блокировали в течение 1 часа 1%-ным BSA в PBS при 37°С.

К кожным кератиноцитам человека добавляли трипсин, и их метили в течение 30 минут при 37°С в кальцеине-АМ при концентрации 5 мкМ и, наконец, промывали три раза в среде Epilife®.

Меченые клетки (4,5×10⁴/микpoлyнкa) добавляли в планшет, предварительно покрытый пептидом XIKVAV, и инкубировали в течение 2 часов при 37°С в атмосфере, увлажненной 5% CO₂.

Клеточную адгезию оценивали путем измерения флуоресценции кальцеина до и после промывки.

Процент клеточной адгезии определяли путем деления флуоресценции прикрепленных клеток на общую флуоресценцию клеток, добавленных в каждую микролунку.

Клеточную адгезию, стимулированную пептидами XIKVAV, вычисляли по отношению к неспецифической адгезии клеток к BSA.

Результаты показывают, что пептиды XIKVAV могут способствовать адгезии кератиноцитов дозозависимым образом (см. Фиг.8, 9 и 10).

Фиксация клеток, вызванная пептидами XIKVAV, составляла 65% по отношению к неспецифической адгезии при самой высокой исследованной концентрации.

Эти результаты показывают, что пептиды XIKVAV распознаются специфическими рецепторами в клеточной поверхности.

Эти открытия позволяют предположить, что пептиды общей формулы XIKVAV являются хорошими кандидатами для образования части косметических препаратов для реструктурирования и повышения плотности кожи.

При рассмотрении и сравнении Фиг.8, 9 и 10, наблюдается усиление клеточной адгезии по мере увеличения дозы пептида (дозозависимым образом).

При сравнении экстраполированных результатов Фиг.9, во всех случаях наблюдается значительное усиление клеточной адгезии кератиноцитов, но существует пептид, обеспечивающий более сильную адгезию, который представляет собой пептид SIKVAV, то есть пептид, в котором Х соответствует серину.

На Фиг.10 показаны уровни клеточной адгезии пептидов SIKVAV-OH и

SIKVAV-NH₂, где наблюдается, что адгезия, вызванная SIKVAV-NH₂, является более сильной при малых дозах (0,5 мкг/мл), а более сильная адгезия пептидов SIKVAV-OH создается при более высоких дозах.

Формула изобретения

1. Применение пептидов XIKVAV общей формулы I

где X выбран из группы, образованной водородом, аминокислотой или ацильной группой, a Y выбран из группы, образованной амино, гидроксилом или тиолом,
отличающееся тем, что они стимулируют биоадгезию кожных клеток путем повышения экспрессии биоадгезивных пептидов.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что X представляет собой водород или серин.

3. Применение по п.1, отличающееся тем, что X представляет собой пальмитоил или деканоил.

4. Применение по п.1, отличающееся тем, что Y представляет собой амино.

5. Применение по п.1, отличающееся тем, что Y представляет собой гидроксил.

6. Применение по п.1, отличающееся тем, что Y представляет собой тиол.

7. Применение по п.1, отличающееся тем, что кожные клетки представляют собой кератиноциты.

8. Применение по п.1, отличающееся тем, что биоадгезивные пептиды представляют собой интегрин альфа-6 и ламинин V.

9. Применение пептидов по любому из пп.1-8 в изготовлении косметической композиции для кожного применения.

10. Применение пептидов по любому из пп.1-8 в изготовлении косметической композиции, повышающей плотность кожи.

11. Косметическая композиция для повышения плотности кожи, отличающаяся тем, что она содержит в косметически приемлемой среде косметически эффективное количество пептидов XIKVAV формулы I

где X представляет собой водород, аминокислоту или ацильную группу, и Y представляет собой амино, гидроксил или тиол.

12. Косметическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что эта косметическая композиция представлена в форме геля, эмульсии, крема, лосьона, шампуня, сыворотки.

13. Косметическая композиция по п.11, отличающаяся тем, что она повышает плотность кожи.

14. Косметическая композиция по п.13, отличающаяся тем, что ее эффект состоит в повышении плотности кожи путем усиления адгезии кожных клеток друг к другу и к базальной мембране.

15. Косметическая композиция по любому из пп.11-14, отличающаяся тем, что количество пептидов XIKVAV составляет вплоть до 12 мас.%.

16. Косметическая композиция по любому из пп.11-14, отличающаяся тем, что она предпочтительно содержит следующие ингредиенты в следующих соотношениях, мас.%:

17. Косметическая композиция по любому из пп.11-14, отличающаяся тем, что количество пептидов XIKVAV составляет вплоть до 5 мас.%.

РИСУНКИ