Патент на изобретение №2370033
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СИНТЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ ХРЯКОВ В ОХЛАЖДЕННОМ СОСТОЯНИИ
(57) Реферат:
Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при искусственном осеменении свиней. Синтетическая среда для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии, включающая глюкозу, двуводную динатриевую соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты, натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный (цитрат натрия), аммоний сернокислый, натрий двууглекислый и воду дистиллированную, отличающаяся тем, что дополнительно содержит в качестве антиоксиданта этиловый спирт при следующем соотношении ингредиентов (мас.%):
Изобретение обеспечивает повышение подвижности, живучести и оплодотворяющей способности сперматозоидов хряка, сохраняемых в охлажденном до 16°С состоянии. 4 табл.
Изобретение относится к искусственному осеменению сельскохозяйственных животных, в частности к синтетическим средам для разбавления и хранения спермы хряков в охлажденном состоянии. Известно, что в процессе хранения разбавленной спермы хряков в охлажденном до 16-18°С состоянии происходит активация процессов перекисного окисления липидов, что отрицательно влияет на подвижность и оплодотворяющую способность сперматозоидов, сохраняемых при этой температуре. В этой связи необходима разработка более совершенных синтетических сред для спермы хряков, позволяющих увеличить сроки хранения разбавленной спермы хряков в охлажденном до 16-18°С состоянии и повысить их оплодотворяющую способность. Известна среда для хранения спермы хряков, содержащая четырехзамещенный ЭДТА, глюкозу медицинскую безводную, цитрат натрия трехзамещенный, аммоний сернокислый и дистиллированную воду [1]. Также известна синтетическая среда для разбавления спермы хряков, содержащая глюкозу, хелатон-3, лимоннокислый трехзамещенный пятиводный натрий, аммоний сернокислый, двууглекислый натрий, спермосан-3, молочнокислый литий и бидистиллированную воду [2]. Недостатком данных сред является то, что они не поддерживают высокую подвижность сохраняемых в охлажденном состоянии сперматозоидов при хранении более 12-24 часов при 16°С, а также не препятствуют развитию процесса перекисного окисления липидов, что снижает оплодотворяющую способность сперматозоидов. Известна синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы хряков, содержащая глюкозу, цитрат натрия 5,5-водный, этилендиаминтетраацетат двунатриевый двуводный, трис (оксиметил) аминометан, сульфат аммония, сорбит, глицерин и антиоксидант – водный экстракт подсолнечного масла [3]. Недостатком данной среды является то, что она предназначена для разбавления и замораживания спермы хряков и не может применяться для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии. Поскольку в процессе замораживания спермы происходят иные физико-химические воздействия на клетку, чем при хранении ее в охлажденном состоянии, поэтому и компоненты среды подбирают соответственно такие, чтобы предотвратить криоповреждения клетки при глубоком до (- 196°С) замораживании. Так, например, важное значение при глубоком замораживании спермы сельскохозяйственных животных имеет защитное действие глицерина. Механизм защитного действия глицерина в основном сводится к следующему: он проникает внутрь клетки и играет роль противосолевого буфера; позволяет вызывать переохлаждение системы путем связывания части свободной воды, что способствует протеканию витрификации ионных процессов; укрепляет мембраны клеток, предохраняя их от повреждающего действия воды при перераспределении ее по обе стороны мембраны. Кроме того, глицерин, проникая в клетку, замещает часть свободной воды и вытесняет электролиты, снижая их внутриклеточную концентрацию до степени, не оказывающей вреда при замораживании. При добавлении глицерина в состав разбавителя он понижает точку замерзания раствора. Наряду с положительным влиянием глицерин может оказывать и отрицательное действие на биологическую полноценность сперматозоидов. Имеются данные, что глицерин способствует разрушению акросом у сперматозоидов. При использовании глицерина из-за его высокой растворяющей способности повреждаются цитоплазматические мембраны вследствие растворения входящих в них компонентов, в частности липидов, что ведет к потере многих жизненно важных соединений клетки. Глицерин подавляет дыхательную активность сперматозоидов. Поэтому, несмотря на положительную роль глицерина и других компонентов, необходимых при замораживании сперматозоидов хряков, их присутствие в среде для хранения спермы хряков в охлажденном до 16°С состоянии нежелательно. Наиболее близким аналогом (прототипом) нашего изобретения является (ГХЦС) среда для разбавления спермы хряков [4], которая содержит следующие компоненты: глюкоза медицинская безводная – 40 г; двуводная динатриевая соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты (трилон-Б) – 2,6 г; натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный (цитрат натрия) – 3,8 г; аммоний сернокислый – 1,8 г; натрий двууглекислый – 0,5 г; вода дистиллированная – 1000 мл; спермосан-3 – 250 тыс.ЕД. Соотношение ингредиентов (мас.%):
Недостатком данной среды является то, что она не содержит антиоксидантов и не позволяет поддерживать высокую оплодотворяющую способность спермы хряков, сохраняемой при 16-18°С. Известно, что в процессе хранения сперматозоидов в охлажденном состоянии в них может происходить накопление супероксидных радикалов, являющихся предшественниками всех активных форм кислорода in vivo. Их образование приводит к повреждению ДНК, белков, липидов и т.д. Стационарность процессов окисления липидов является важным условием стабильности и функционирования клеточных мембран, поскольку установлено, что при развитии ПОЛ изменяется как жирнокислотный состав мембран, так и их физико-химические свойства (микровязкость, текучесть, мембранный потенциал, полярность внутренних областей мембраны и т.п.). Следствием этого является изменение транспортных свойств мембраны и активности мембранно-связанных ферментов. С целью предотвращения ПОЛ и накопления токсичных продуктов пероксидации липидов некоторые исследователи предлагают использовать в составе синтетических сред для разбавления спермы животных различные антиоксиданты. Целью изобретения является повышение живучести и оплодотворяющей способности сперматозоидов хряка при разбавлении и хранении в охлажденном до 16°С состоянии. Поставленная цель достигается тем, что среда, включающая: глюкозу; двуводную динатриевую соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты (трилон-Б); натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный (цитрат натрия); аммоний сернокислый; натрий двууглекислый и воду дистиллированную, дополнительно содержит в качестве антиоксиданта этиловый спирт при следующем соотношении ингредиентов (мас.%):
Этиловый спирт – бесцветная жидкость, во всех соотношениях хорошо смешивается с водой, химическая формула – С2Н5OH, молекулярная масса 46,069. При включении в состав среды в нетоксичных концентрациях существенно не изменяет осмотическое давление и pH среды. Этиловый спирт обладает антиоксидантными свойствами [5]. Введение этилового спирта в оптимальном количестве в состав среды для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии позволяет снизить вероятность активации процесса перекисного окисления липидов в сохраняемой сперме хряков. Ранее этиловый спирт в составе сред для спермы животных не использовался. Допустимые граничные значения концентраций компонентов в заявленной среде приведены в таблице 1.
Если содержание компонентов выходит за границу крайних нижних или верхних значений предполагаемой среды, то это дает худшие результаты и не приводит к достижению поставленной цели (таблица 2).
Пример приготовления среды. В стерильную химическую колбу вносят по рецепту оптимальный (второй) состав предлагаемой среды в мас.%: глюкозу медицинскую безводную – 3,85; натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный – 0,37; двуводную динатриевую соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты – 0,27; аммоний сернокислый – 0,19; натрий двууглекислый – 0,055; этиловый спирт – 0,15; вода дистиллированная – остальное и санирующий препарат (согласно наставлению по его применению). Свежеприготовленная синтетическая среда перед разбавлением спермы должна исследоваться по внешнему виду, цвету и периодически по показателю pH и осмотическому давлению. Предлагаемая синтетическая среда по физико-химическим свойствам должна отвечать следующим требованиям: внешний вид – прозрачная жидкость без осадка и механических примесей; без запаха; pH – при температуре 20°С – 6,7±0,10; осмотическое давление – 7,0-8,5 атм. Приготовленную среду используют для разбавления спермы в течение 3-4x часов с момента приготовления. При использовании среды к 1 объему спермы добавляют 1-6 объемов среды в зависимости от концентрации сперматозоидов. Разбавленную сперму хряков хранят в термостате при 16°С. Преимуществами заявленной среды является повышение живучести сперматозоидов и их оплодотворяющей способности при хранении спермы в охлажденном до 16°С состоянии. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Изучение воздействия этилового спирта в составе среды на биологическую полноценность сперматозоидов хряка. Сперму для исследования получали от хряков крупной белой породы мануальным способом. После взятия каждого эякулята определяли его объем и ряд качественных показателей (активность спермиев в процентах, концентрацию в млрд/мл, общее количество сперматозоидов в эякуляте в млрд.). Для изучения воздействия этилового спирта в составе среды на сохранение биологической полноценности сперматозоидов хряка, вне организма при разбавлении спермы были использованы следующие его концентрации: 0,025; 0,05; 0,075; 0,10; 0,15; 0,20 и 0,25 мас.%. В контрольной группе нативную сперму хряка разбавляли ГХЦС средой. Разбавленную сперму расфасовывали в пронумерованные флаконы и вместе с контрольным образцом хранили при 16°С, периодически определяя подвижность сперматозоидов через каждые 24 часа до полной их гибели. Затем вычисляли абсолютный показатель живучести (Sa) сперматозоидов. Проведенные исследования показали, что при использовании в опыте этилового спирта в составе предлагаемой среды в концентрации 0,075-0,20 мас.% наблюдали повышение абсолютного показателя живучести сперматозоидов от 1022 до 1079 усл.ед. в то время как в контроле, где использована ГХЦС среда (прототип), абсолютный показатель живучести сперматозоидов был равен 762 усл.ед. В результате абсолютный показатель живучести в предлагаемой среде на 34-41% больше по сравнению с контролем (прототипом). Результаты представлены в таблице 3.
Пример Испытание предлагаемой среды в производственных условиях. Предложенная среда для разбавления и хранения спермы хряков в охлажденном до 16°С состоянии при следующем соотношении компонентов (в мас.%): глюкоза – 3,85; натрий лимонно-кислый трехзамещенный пятиводный – 0,37; двуводная динатриевая соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты – 0,27; аммоний сернокислый – 0,19; натрий двууглекислый – 0,055; этиловый спирт – 0,15; вода дистиллированная – остальное и санирующий препарат (согласно наставлению по его применению), была испытана в производственных условиях на оплодотворяющую способность спермы, сохраняемой в течение 24х часов. Осеменение свиноматок проводили комиссионно на свинокомплексе ЗАО «Мордовский бекон» в республике Мордовия. Предлагаемой средой осеменили 146 голов свиноматок, средой ГХЦС (прототип) 128 голов, опоросилось соответственно 124 и 98 свиноматок. Результаты представлены в таблице 4.
Испытания показали, что предложенная среда для разбавления и хранения спермы хряков в охлажденном до 16°С состоянии повысила оплодотворяемость свиноматок на 5,8% и их многоплодие на 0,3 поросенка по сравнению с контролем (прототипом). Таким образом, введение этилового спирта в состав предлагаемой среды для разбавления и хранения спермы хряков в охлажденном до 16°С состоянии позволяет значительно улучшить биологическую полноценность сперматозоидов (абсолютный показатель живучести на 34-41%), а также повысить оплодотворяемость свиноматок на 5,8% и их многоплодие на 0,3 поросенка по сравнению с контролем (прототипом) ГХЦС средой. Источники информации 1. А.С. СССР 2. А.С. СССР 3. Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1981, с.69.
Формула изобретения
Синтетическая среда для хранения спермы хряков в охлажденном состоянии, включающая глюкозу, двуводную динатриевую соль этилендиамин-NNNN-тетрауксусной кислоты, натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный (цитрат натрия), аммоний сернокислый, натрий двууглекислый и воду дистиллированную, отличающаяся тем, что дополнительно содержит в качестве антиоксиданта этиловый спирт при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.