Патент на изобретение №2369867

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНЫХ СРЕД

(57) Реферат:

Изобретение относится к анализу воды особыми способами применительно к токсикологической оценке качества водных сред и к экологическому контролю с диагностическими и исследовательскими целями. Способ включает забор пробы водной среды, ее фильтрацию, коррекцию pH до физиологических значений и последующий ее анализ, причем к одной объемной части исследуемой пробы водной среды добавляют две объемные части 10% раствора бычьего сывороточного альбумина, перемешивают, помещают каплю полученного материала на предметное стекло и высушивают при комнатной температуре в течение 18-24 часов, анализируют структурный макропортрет дегидратированной капли с помощью светового микроскопа и при наличии характерных особенностей в виде штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда определяют токсичность водных сред. Достигается быстрота, достоверность и упрощение определения. 3 ил.

Изооретение относится к анализу воды особыми способами и может быть использовано в биологии и экологии для токсикологической оценки качества водных сред, в том числе и водных вытяжек отходов в области охраны окружающей среды, а также при экологическом контроле с диагностическими или исследовательскими целями.

Проблемы загрязнения окружающей среды требуют разработки и реализации эффективных методов контроля токсичности водных сред.

Известный способ заключается в том, что отбирают жидкие осадки, фильтруют, измеряют pH, температуру и содержание O₂ в полученном экстракте (водная вытяжка из осадков сточных вод или отходов должна иметь pH=7,0-8,2, температуру 20±2°C, концентрацию растворенного кислорода не ниже 6 мг/дм³) и анализируют в 100, 30, 9, 3 и 1%-ной концентрациях. В процессе приготовления разбавлений пробы тщательно перемешивают. Разбавления в трех параллельных сериях. В качестве контроля используется три параллельные серии с культивированной водой.

Учет смертности дафний в опыте и контроле проводят через каждый час до конца первого дня опыта, а затем 2 раза в сутки ежедневно до истечения 96 часов.

Для определения токсичности исследуемых вод, водной вытяжки рассчитывается процент погибших в тестируемой воде дафний (A, %) по сравнению с контролем:

,

где X_k – количество выживших дафний в контроле; X_t – количество выживших дафний в тестируемой воде.

При A<10% тестируемая вода или водная вытяжка не оказывает токсического действия (безвредная кратность разбавления). При A>50% тестируемая вода, водная вытяжка оказывает токсическое действие (средняя летальная кратность разбавления).

Известен способ определения токсичности водных сред с использованием лейкоформы красителя трифенилметанового ряда (Способ определения токсичности водной среды. Авторы: Эрнестова Л.С., Власова Г.В. Номер публикации 2007713, Дата публикации 1994.02.15, Заявка 4952638/04. Дата подачи заявки 1991.06.28. Опубликовано 1994.02.15. Номер редакции МПК5. Основной индекс МПК G01N 33/18).

Известный способ заключается в том, что отбирают пробу водной среды, фильтруют, добавляют тестирующую смесь, состоящую из лейкоформы красителя трифенилметанового ряда и гликолевого реактива при соотношении, равном (0,5-1):(0,0005-0,0015). Вода считается токсичной при величине адсорбции выше 0,3 мкг·экв/л.

Однако известный способ имеет невысокую чувствительность и для его осуществления требуется наличие дорогостоящего оборудования.

За прототип предлагаемого способа выбран известный способ определения токсичности водных сред, включающий исследование активности Mg²⁺-ATФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната (Способ определения токсичности водной среды (варианты), реагент для определения токсичности водной среды, применение Mg²⁺-ATФазы плазматических мембран мозга животных. Авторы: Попов А.А., Мензиков С.А., Мензикова О.В. публикации 2266539, дата публикации 2005.12.20, заявка 2004129244/15, дата подачи заявки 2004.10.05. Номер редакции МПК7. Основной индекс МПК G01N 33/18, G01N 33/48, C02F 1/68).

Известный способ осуществляют следующим образом. Пробу водной среды фильтруют, доводят до физиологических значений pH не содержащим фосфор буфером, добавляют плазматические мембраны мозга животных, перемешивают. Затем добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната и инкубируют. По снижению активности Mg²⁺-ATФазы, определяемой по концентрации неорганического фосфора, определяют токсичность водной среды.

Однако известный способ имеет ряд недостатков: он весьма дорог в осуществлении, трудоемок, требует наличия значительного количества реактивов и биологического материала, полученного при забое животных.

Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение возможности быстрого и достоверного определения токсичности водных сред при минимальном количестве исследуемого материала и необходимых реактивов.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения токсичности водных сред, включающем забор пробы водной среды, ее фильтрацию и коррекцию pH до физиологических значений, к одной объемной части исследуемой пробы водной среды добавляют две объемные части 10% раствора бычьего сывороточного альбумина, перемешивают, высушивают каплю материала на горизонтально расположенном стекле при комнатной температуре в течение 18-24 часов, анализируют структурный макропортрет дегидратированной капли с помощью светового микроскопа и при наличии характерных особенностей в виде штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин, трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда определяют токсичность водных сред.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию «новизна», так как в процессе проведенных патентно-информационных исследований по патентной и научно-технической литературе не выявлено источников информации, которые бы порочили новизну изобретения.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию «изобретательский уровень», так как не выявлено технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.

Авторы предлагаемого способа не обнаружили в научно-технической литературе сведений о возможности применения метода клиновидной дегидратации для оценки токсичности в водных средах.

6. – С.104-108).

Предварительно была проведена исследовательская работа по определению наиболее подходящей концентрации альбумина в анализируемой пробе. В ходе экспериментальной разработки способа были изучены объемные соотношения 1:1, 1:2; 1:3; 1:5; 1:10; 1:50; 1:100; 2:1; 3:1; 5:1; 10:1.

Наиболее информативными были результаты, полученные с применением 10% раствора бычьего сывороточного альбумина в объемном соотношении 2:1 к исследуемой жидкости.

В ходе разработки предлагаемого способа экспериментальным путем была доказана необходимость и достаточность для определения токсичности водных сред наличия в высохшей капле смеси, состоящей из одной объемной части исследуемой пробы водной среды и двух объемных частей 10% раствора бычьего сывороточного альбумина, характерных особенностей в виде штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин, трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда.

Были исследованы и проанализированы 15 образцов водных сред и водных извлечений, доставленных в лабораторию промышленной и экологической токсикологии НИИ химии Нижегородского государственного университета для проведения биологического тестирования с целью определения их токсических свойств. Из них 1 проба отличалась высокой токсичностью (гибель 100% организмов в неразбавленной пробе), 3 – средней степенью токсичности (гибель организмов в диапазоне от 50 до 100%), 6 – слабой степенью токсичности (гибель организмов в диапазоне от 10 до 50%). Также были исследованы заведомо нетоксичные образцы культивационной воды, использовавшиеся в качестве контроля при проведении биологического тестирования (5 образцов).

На фиг.1 показано изображение высохшей капли смеси, содержащей 1 объемную часть нетоксичной артезианской воды ТЗ «Королевская вода» и 2 части

10% раствора сывороточного бычьего альбумина (ув.×15).

На фиг.2 показано изображение высохшей капли смеси, содержащей 1 объемную часть водных хозяйственно-бытовых стоков после очистных сооружений и 2 части 10% раствора сывороточного бычьего альбумина (ув.×15). Цифрой 1 показаны штриховые трещины, 2 – круглые трещины, 3 – параллельные трещины.

Предложенным способом исследовали 15 проб водных сред. Параллельно проводили биологическое тестирование с использованием дафний Ceriodaphnia affinis. При помощи программного пакета «Statistics» была проведена обработка результатов двух методов. Коэффициент корреляции по Пирсону между результатами (процент гибели) биотестирования и количеством особенностей в структурном макропортрете водных сред с добавлением альбумина составил 0,33 при вероятности р=0,048, что свидетельствует о достоверной связи между двумя этими показателями.

Предлагаемый способ при использовании дает следующий положительный эффект. Способ позволяет определить наличие токсичности водных сред и предварительно оценить ее величину.

В качестве основного преимущества метода клиновидной дегидратации перед методом биотестирования является отсутствие в необходимости культивирования тест-организмов, что значительно снижает расходы на заработную плату персонала и себестоимость анализа. Способ прост в исполнении, занимает меньше времени, чем биотестирование, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, большого количества исследуемого материала, что позволяет в дальнейшем проводить другие виды исследований. Способ может быть использован в токсикологической оценке качества водных сред при экологическом контроле.

Предполагаемый способ осуществляется следующим образом.

Производят забор водной среды, фильтруют ее и доводят pH до физиологических значений. К одной объемной части исследуемой жидкости добавляют две объемные части 10% раствора бычьего сывороточного альбумина, перемешивают. Затем на предметное стекло, специальным образом обработанное, расположенное строго горизонтально, наносят каплю приготовленной смеси объемом 0,01 мл (10 мкл). При этом диаметр капли составляет около 5 мм. Делают 6 повторов для проверки достоверности и взаимной идентичности высохшей капли. Высушивание проводят при температуре 20-25°C и относительной влажности 65-70% вдали от нагревательных приборов и прямых солнечных лучей при минимальной подвижности окружающего воздуха. В процессе высыхания капля должна быть неподвижной. Продолжительность периода высыхания составляет 18-24 часа. Вид и структуру дегидратированной капли оценивают с помощью микроскопа в отраженном свете при увеличении 10×8. При наличии в исследуемой жидкости токсических веществ, наблюдаем в высохшей капле смеси характерные особенности в виде штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин, трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда.

Примеры использования предлагаемого способа при установлении локализации белков в биологических жидкостях.

Пример 1. Для выявления токсичности к одной объемной части артезианской воды ТЗ «Королевская вода» добавляли 2 части 10% раствора альбумина. В высохшей капле смеси выявлено практически полное отсутствие особенностей (фиг.1). По результатам биологического тестирования по показателю безвредной кратности разбавления вод вода «Королевская» не токсична (Бкр 10=1,00).

Пример 2. Водные хозяйственно-бытовые стоки после очистных сооружений тестировали предложенным способом. В высохшей капле смеси выявлено значительное количество особенностей: штриховые, круглые и параллельные трещины (фиг.2). По результатам биологического тестирования по показателю безвредной кратности разбавления вод водные хозяйственно-бытовые стоки после очистных сооружений высокотоксичны (Бкр 10=92,00).

На фиг.3 представлено изображение таблицы аномальных особенностей структурного макропортрета смеси, содержащей 1 объемную часть водных отходов и 2 части 10% раствора сывороточного бычьего альбумина: штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, круглых трещин, трещин типа черная сеть и рыбья чешуя; морщин, линий Валнера, языков Арнольда.

Таким образом, с помощью вышеуказанного способа можно объективно установить наличие токсичности в водных средах. Данный способ при достаточно высокой чувствительности не требует каких-либо специальных условий и предназначен для проведения массовых анализов.

Формула изобретения

Способ определения токсичности водных сред, включающий забор пробы водной среды, ее фильтрацию, коррекцию рН до физиологических значений и последующий ее анализ, отличающийся тем, что к одной объемной части исследуемой пробы водной среды добавляют две объемные части 10%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, перемешивают, помещают каплю полученного материала на предметное стекло и высушивают при комнатной температуре в течение 18-24 ч, анализируют структурный макропортрет дегидратированной капли с помощью светового микроскопа и при наличии характерных особенностей в виде штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда определяют токсичность водных сред.

РИСУНКИ