Патент на изобретение №2369398

(54) СРЕДСТВО С РАНОЗАЖИВЛЯЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ НА ОСНОВЕ СУПЕРНАТАНТА ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ФИБРОБЛАСТОВ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, акушерству, гинекологии и дерматологии, и касается средств, обладающих репаративным и регенераторным действием на раны различного происхождения. Предложено средство, обладающее ранозаживляющей активностью на основе супернатанта человеческих диплоидных фибробластов, при этом оно дополнительно содержит плазму крови человека О (I) группы резус-положительная, инсулин простой, нуклеинат натрия, комплекс аминокислот «Инфезол 100», концентрат жиров «Липофундин МСТ/ЛСТ 20%», соли, глюкозу и витамины. Изобретение обеспечивает создание высокоэффективного комплексного лекарственного средства, обладающего ранозаживляющей активностью и не содержащего веществ, не разрешенных к клиническому применению.

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам, обладающим репаративным и регенераторным действием на раны различного происхождения и используемым в хирургии, акушерстве и гинекологии, дерматологии.

Известны попытки использования, с одной стороны, донорской плазмы и ее компонентов («Средство для стимуляции эпителизации раны», патент 2222317; «Лекарственное средство и способ бесшовного лечения ран», патент 2002134900), с другой стороны, супернатанта клеточных культур или его фракций («Средство для изменения скорости роста или репродукции клеток, способ его получения, способ стимуляции заживления ран или лечения ожогов, способ коррекции косметического дефекта, способ ингибирования старения кожи и способ стимуляции роста волос», патент 2280459; «Therapeutic agent for dermatosis and covering material for treating dermatosis using concentrated solution of extracellular matrix», патент JР2004339107). Однако использование кондиционированной клетками культуральной среды в клинической медицине в настоящий момент не представляется возможным, т.к. часть компонентов сред не зарегистрированы в Государственной Фармакопее и, соответственно, не имеют разрешения на клиническое применение. Использование цельной плазмы способствует формированию плотного фибринового налета на ране, который может не только стимулировать репарацию, но и, наряду с другими белковыми, липидными и углеводными компонентами плазмы, способствовать развитию микробного воспаления и ухудшению состояния раны. В то же время выделение из плазмы лишь отдельных компонентов, например, фибронектина или тромбина, лишает лекарственное средство других биологически активных составляющих плазмы, являющихся стимуляторами роста и размножения эпителия и продукции внеклеточного матрикса (ростовые факторы, цитокины, гормоны).

Наиболее близким является: «Вещество, обладающее противовоспалительной, иммуномодулирующей и ранозаживляющей активностью» (Патент на изобретение 2300384 от 10.06.2007 г.). Указанное средство имеет главный недостаток – содержит культуральную среду, обладающую вышеуказанным ограничением для медицинского использования.

Задачей изобретения является создание высокоэффективного комплексного лекарственного средства, обладающего ранозаживляющей активностью и не содержащего веществ, не разрешенных к клиническому применению. Поставленная задача достигается максимально точным воспроизведением состава культуральной среды за счет использования зарегистрированных официнальных препаратов. Кроме того, с целью усиления репаративной активности супернатанта фибробластов в конечный продукт добавлен ряд лекарственных средств, обладающих репаративной активностью (инсулин, натрия нуклеинат), а также разведенная донорская плазма, что обеспечило сохранение достаточных концентраций биологически активных веществ, но позволило избежать указанных ранее негативных моментов применения цельной плазмы. Состав ранозаживляющего средства следующий:

– кондиционированный конфлюэнтной культурой
нормальных человеческих фибробластов суточный
супернатант на 0,9% изотоническом растворе
натрия хлорида	300 мл
– комплекс аминокислот «Инфезол 100»	5 мл
– концентрат жиров «Липофундин МСТ/ЛСТ 20%»	5 мл
– глюкоза	20 мл 5% раствора
– кальция глюконат	5 мл 10% раствора
– калия хлорид	10 мл 4%
– магния сульфат	0,4 мл 25% раствора
– натрия гидрокарбонат	55 мл 4% раствора
– аскорбиновая кислота	1 мл 5% раствора
– никотинамид	1 мл 2,5% раствора
– пиридоксина хлорид	1 мл 5% раствора
– тиамина хлорид	1 мл 2,5% раствора
– лейковорин	1 мл 1% раствора
– рибофлавин	1 мл 1% раствора
– плазма крови человека 0 (I) группы резус-
положительная	75 мл
– инсулин простой	200 ЕД
– натрия нуклеинат	50 мл 0,25% раствора
– изотонический раствор натрия хлорида 0,9%	до 1 л

Для предлагаемого состава разработана технология приготовления. Перевиваемые линии нормальных человеческих фибробластов (НЧФ) получали бесферментативным способом. Кусочки тканей (кусочки дермы, легких, губчатая кость, содержащая красный костный мозг) подвергали механической дезагрегации до фрагментов размером 0,1-0,2 мм³, добавляли питательную среду MEM, дополненную 10% сыворотки эмбрионов коров. Фрагменты тканей ресуспендировали в указанной среде, вносили в культуральные пластиковые флаконы и культивировали во влажной атмосфере с 5% СО₂. В течение 1-3 суток происходила миграция фибробластов из тканевых фрагментов и прикрепление к дну культуральных флаконов. После этого фрагменты тканей со средой из флаконов удаляли, а к прикрепленным клетками добавляли свежую культуральную среду. После формирования на дне культуральных флаконов монослоя НЧФ отработанную питательную среду удаляли, клетки трижды отмывали от остатков среды стерильным изотоническим 0,9% раствором натрия хлорида, подогретого до 37°С, а затем к клеткам стерильно добавляли состав из аминокислот, жиров, глюкозы, солей и витаминов, разведенных в 0,9% изотоническом растворе натрия хлорида в указанных выше соотношениях, и вновь культивировали в течение 24 ч в стандартных условиях. Через сутки полученный таким образом кондиционированный НЧФ супернатант сливали и использовали для приготовления ранозаживляющего средства. До клинического использования биоматериала проводили обследование донора фибробластов на отсутствие возбудителей сифилиса, ВИЧ-инфекции, гепатитов В и С, а также проводили исследование самой культуры на наличие внутриклеточных возбудителей (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Herpes simplex virus тип I и II, Cytomegalovirus, Human papillomavirus тип 16 и 18), при выявление которых весь биоматериал отбраковывался.

Для приготовления ранозаживляющего средства с целью последующего клинического применения в стерильную 1000 мл стеклянную бутылку к 300 мл кондиционированного конфлюэнтной культурой НЧФ супернатанта добавляли 75 мл донорской плазмы 0 (I) группы резус-положительной, которую получали на Курской ОСПК. Затем стерильно добавляли 200 ЕД простого инсулина, 50 мл 0,25% раствора натрия нуклеината и доводили общий объем до 1000 мл 0,9% раствором натрия хлорида.

Влияние препарата на сроки эпителизации ожоговой раны.

Пример 1

Проведено исследование эффективности и безопасности применения предлагаемого препарата у больных с термическим ожогом IIIa степени. Для исследования отобраны 12 больных с ожогом указанной глубины, расположенном на передней и боковых поверхностях брюшной стенки. На левую боковую поверхность накладывали стерильную салфетку, пропитанную раствором 0,05% фурацилина (контроль 1), на переднюю брюшную стенку наносили мазь «Дермазин», представляющую собой сульфадиазин серебра на гидрофильной основе и рекомендованную для лечения поверхностных и пограничных ожогов (контроль 2), на правую боковую поверхность – салфетки, пропитанные предлагаемым составом. В течение суток салфетки с растворами орошали соответствующими препаратами (фурацилин и исследуемый состав) для предотвращения их полного высыхания. Под внутривенным наркозом каждые 48 ч осуществляли перевязки с туалетом раны и сменой салфеток. При формировании струпа на ране его тангенциально иссекали в условиях операционной. Средний срок самостоятельной эпителизации ожоговой раны на участке использования предлагаемого нами препарата составил (M±tm) 10,83±1,23 сут, в контроле 1-17,83±1,27 сут, а в контроле 2-14,42±1,04 суток.

Таким образом, предлагаемый нами состав статистически значимо (р<0,05) сокращал сроки спонтанной эпителизации пограничного ожога как в сравнении со стандартным раствором антисептика, так и по сравнению с современной мазью антимикробного действия, входящей в стандартную терапию указанной травмы.

Пример 2

Проведено исследование эффективности и безопасности применения предлагаемого препарата у больных с трофическими язвами голени на фоне варикозной болезни и посттромбофлебитического синдрома. Для исследования отобраны 15 больных с одиночной язвой голени. Условием отбора являлось отсутствие гнойного воспаления, аллергических реакций на компоненты ранозаживляющего средства и белковые препараты в анамнезе. Средний срок существования язвы составил (M±tm) 2,80±1,17 мес. Средняя площадь язвы (M±tm) – 18,73±3,69 см². Все пациенты ранее проходили стандартное лечение противомикробными мазями («Левосин» или «Левомеколь») и одним из репаративных препаратов: «Актовегин-гель» или «Куриозин» без видимого эффекта.

После туалета язвы 0,1% раствором гипохлорита натрия и просушивания стерильным марлевым тампоном на язву накладывали стерильную салфетку, пропитанные предлагаемым составом. В течение суток салфетку орошали исследуемым составом для предотвращения ее полного высыхания. Смену повязок с этапным туалетом язвы осуществляли ежедневно. Окончательную оценку эффективности проводили через 28 дней. Для статистической обработки результатов использовали парный критерий Стьюдента. В результате лечения в среднем площадь язв сократилась на (M±tm) 13,27±3,04 см и составила (M±tm) 5,47±2,46 см² (р<0,001). При этом у 4 пациентов отмечена полная эпителизация трофических язв.

Таким образом, предлагаемый нами состав способствует статистически значимому сокращению площади трофических язв, обусловленных венозной недостаточностью, ранее рефракторных к стандартному лечению.

Формула изобретения

Средство, обладающее ранозаживляющей активностью на основе супернатанта нормальных человеческих фибробластов, отличающееся тем, что дополнительно содержит плазму крови человека О (I) группы резус-положительная, инсулин простой, нуклеинат натрия, комплекс аминокислот «Инфезол 100», концентрат жиров «Липофундин МСТ/ЛСТ 20%», соли, глюкозу и витамины при следующем соотношении компонентов: