Патент на изобретение №2369332

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖЕСТКОСТИ КОСТАМЕРА МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, более точно к биофизике, биомеханике, и может быть использовано для определения жесткости костамера мышечных волокон. Проводят выделение одиночного мышечного волокна, прикрепляют его к дну жидкостной ячейки атомного силового микроскопа, определяют на воздухе резонансную частоту колебаний. Подводят кантилевер к дну жидкостной ячейки, получают в контактном режиме калибровочную силовую кривую и определяют по ней калибровочный коэффициент а (в м/А). Определяют локализацию костамера путем сканирования поверхности волокна. Переводят систему в контактный режим и получают силовые кривые на выпуклостях, соответствующих костамеру, по которым находят отклонение кантилевера (в А), обобщенную глубину продавливания (в м) с последующим вычислением реальной глубины продавливания волокна (h_s) и реальной приложенной к нему силы (F_s) по формулам h_s=x-y·a, F_s=y·a·k_c, где h_s – реальная глубина продавливания (в м), x – обобщенная глубина продавливания (в м), y – измеряемое отклонение кантилевера (в А), а – калибровочный коэффициент (в м/А), F_s – реальная приложенная к волокну сила (в Н), k_c – коэффициент жесткости кантилевера (в Н/м). Способ позволяет повысить точность определения жесткости костамера мышечных волокон. 1 табл.

Предлагаемое изобретение относится к медицине, более точно к биофизике, биомеханике, и может быть использовано для определения жесткости костамера мышечных волокон.

Полагая, что изменение механических свойств костамера под действием внешних факторов, может приводить к запуску различных сигнальных путей, представляется особенно важным дифференцированно и корректно определять жесткость костамера. Результат таких измерений, возможно, позволит глубже проникнуть в малопонятный к настоящему времени механизм связи между мутациями в генах, кодирующих различные белки внесаркомерного цитоскелета, и механическими свойствами мышечных волокон, что может дать возможность в дальнейшем разработать методы коррекции этих патологических явлений.

В настоящее время наиболее информативным методом, применяемым для получения информации о поперечной жесткости как миофибриллярного аппарата, так и сарколеммы со связанными с ней костамерами является атомная силовая микроскопия. Определение механических характеристик обычно проводят в контактном режиме в жидкости, снимая силовые кривые, и, затем, используя решение контактной задачи Герца, вычисляют модуль Юнга и поперечную жесткость.

Однако в представленных работах исследователи не дифференцировали участки, на которых были определены механические характеристики, в связи с чем остается неясным вопрос о причинах существенных различий в данных авторов. Можно лишь предполагать, что это обусловлено как неравномерностью отногенетической экспрессии белков внесаркомерного цитоскелета, так и видовыми различиями, но наиболее вероятным кажется то, что исследователи проводили измерения на различных участках мышечного волокна, не дифференцируя их.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение точности определения жесткости костамера мышечных волокон за счет предварительного сканирования поверхности образца. Нами показано, что учет начального отклонения кантилевера и фиксирование глубины продавливания позволяет более точно определить жесткость и модуль Юнга.

Этот технический результат достигается тем, что в известном способе определения поперечной жесткости мышечных волокон путем выделения их, снятия силовых кривых и проведения математичесих расчетов, проводят выделение одиночного мышечного волокна, прикрепляют его к дну жидкостной ячейки атомного силового микроскопа, определяют на воздухе резонансную частоту колебаний, подводят кантилевер к дну жидкостной ячейки, получают в контактном режиме калибровочную силовую кривую и определяют по ней калибровочный коэффициент а (в м/А), далее определяют локализацию костамера путем сканирования поверхности волокна, переводят систему в контактный режим и получают силовые кривые на выпуклостях, соответствующих костамеру, по которым находят отклонение кантилевера (в А), обобщенную глубину продавливания (в м) с последующим вычислением реальной глубины продавливания волокна (h_s) и реальной приложенной к нему силы (F_s) по формулам

h_s=x-y·a,

F_s=y·a·k_c,

где h_s – реальная глубина продавливания (в м),

x – обобщенная глубина продавливания (в м),

y – измеряемое отклонение кантилевера (в А),

a – калибровочный коэффициент (в м/А),

Fs – реальная приложенная к волокну сила (в Н),

k_c – коэффициент жесткости кантилевера (в Н/м);

после чего определяют поперечную жесткость костамера k_s (в Н/м) по формуле ,

где h_s – изменение глубины продавливания волокна (в м),

F_s – соответствующее h_s изменение приложенной к волокну силы (в Н),

и затем строят кривую F_s(h_s) и аппроксимируют ее следующей зависимостью, отражающей решение контактной задачи Герца для скругленного кончика кантилевера:

,

где µ_s – коэффициент Пуассона, который, считая клетку несжимаемой, обычно принимают равным 0,5; r_c – радиус скругления кончика кантилевера. Исходя из значения параметра, связывающего приложенную силу и глубину продавливания, а также зная радиус скругления кончика, вычисляют модуль Юнга костамера, [E_s]=Па.

Длина костамера, то есть расстояние от поверхности волокна до миофибриллярного аппарата, ориентировочно составляет по разным данным от 100 нм до 500-700 нм. При этом жесткость, определенная при глубинах продавливания до 100 нм, отражает скорее жесткость мембраны, а более 500-700 нм – жесткость сократительного аппарата.

Сканирование поверхности в полуконтактном режиме заявляемого способа можно осуществлять с помощью более мягкого контактного кантилевера с тем, чтобы затем провести снятие силовых кривых в районе выпуклостей поверхности, не прибегая к замене датчика и, тем самым, не рискуя сместить образец.

Способ осуществляется следующим образом.

Одиночные мышечные волокна, выделенные либо из целой мышцы животного, либо из биоптатов мышцы человека, прикрепляют к дну жидкостной ячейки атомного силового микроскопа, каким-либо образом фиксируя их концы (например, с помощью специального клея Fluka shellac wax-free фирмы Sigma, Германия), и заполняют ячейку жидкостью (например, релаксирующим раствором).

Сначала на воздухе определяют резонансную частоту колебаний каждого используемого кантилевера, и затем вычисляют его жесткость k_c (в Н/м).

Далее подводят зонд к дну жидкостной ячейки и в контактном режиме снимают калибровочную силовую кривую, отражающую зависимость отклонения кантилевера (в нА) от смещения головки (в нм) и вычисляют коэффициент пересчета а (в м/А).

Затем в полуконтактном режиме подводят зонд к мышечному волокну и сканируют поверхность. Далее переводят систему в контактный режим и снимают силовые кривые в интересующих точках поверхности волокна, а именно на выпуклостях, соответствующих костамеру, получая зависимость y(x), где [y]=нА, [x]=нм. Затем пересчитывают эти зависимости с учетом калибровочной кривой следующим образом. Реальная глубина продавливания волокна и приложенная к нему сила вычисляются так:

Затем строят кривую F_s(h_s) и аппроксимируют ее следующей зависимостью, отражающей решение контактной задачи Герца для скругленного кончика кантилевера:

,

где µ_s – коэффициент Пуассона, который, считая клетку несжимаемой, обычно принимают равным 0,5; r_c – радиус скругления кончика кантилевера. Исходя из значения параметра, связывающего приложенную силу и глубину продавливания, а также зная радиус скругления кончика, вычисляют модуль Юнга костамера, [E_s]=Па.

Далее определяют поперечную жесткость на фиксированной глубине продавливания (в нашем случае – 150 нм) по формуле

, .

Пример реализации способа.

В эксперименте использовали семь половозрелых самцов крыс линии Вистар в возрасте 2 месяцев, выращенных в питомнике ГНЦ РФ ИМБП РАН. Животных содержали в стандартных условиях. Они получали корм в соответствии с рационом для лабораторных животных и воду ad libitum. Все процедуры с животными были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ ИМБП РАН.

₂EGTA, 2,5 мМ АТФ) и глицерола.

В день эксперимента пробы переносили в раствор R, в котором выделяли одиночные мышечные волокна. Для измерения жесткости костамера выделенные волокна прикрепляли к дну жидкостной ячейки атомно-силового микроскопа, фиксируя их кончики с помощью специального клея Fluka shellac wax-free (Sigma).

Измерения жесткости костамера мышечных волокон проводили, используя инвертированный микроскоп Olympus XI, соединенный с атомной силовой головкой SMENA (NT-MDT, Россия). Жесткость (Н/м) для каждого кантилевера корректировалась по положению резонанса.

Для работы в жидкости использовали самые мягкие кантилеверы с коэффициентом жесткости на уровне 0,05 Н/м. Применялся полуконтактный режим для получения изображения и контактный для измерения поперечной жесткости. Радиус r_c кривизны кончика всех использованных кантилеверов считался равным 10 нм.

Положение костамера определяли по изображению, формируемому при сканировании образца, принимая за искомую структуру периодические выпуклости поверхности волокна.

Для определения глубины продавливания h_s мягкого волокна использовалось две силовые кривые: измеренная в точке интереса на волокне и измеренная на стекле при тех же значениях приложенной силы F_s.

Поперечную жесткость образца k_s (пН/нм) находили по формуле

,

при этом максимальная глубина продавливания составляла 300 нм.

Модуль Юнга образца E_s (кПа) вычисляли, используя решение контактной задачи Герца по формуле

,

где µ_s=0,5.

Полученные в ходе эксперимента результаты статистически обрабатывали с помощью стандартных методов, реализованных в Microsoft Excel. Данные представляли в виде М±m, где М – среднее значение оцениваемой величины, m – стандартная ошибка среднего значения.

В полуконтакном режиме сканирования получено изображение поверхности мышечного волокна крысы, на котором отчетливо видны выпуклости поверхности, ассоциированные с наличием подмембранной структуры – костамера.

Для определения механических характеристик были сняты силовые кривые в трех типах точек и определены поперечная жесткость и модуль Юнга различных типов структур мышечных волокон (таблица 1): на утолщении поверхности волокна (костамер), на мембране посередине между костамерами (проекция М-линии) и между проекцией М-линии и костамером (собственно поперечная жесткость сарколеммы).

Все полученные отличия статистически достоверны (р<0,01).

Полученные результаты свидетельствуют о неоднородности механических характеристик вдоль мышечного волокна, которая обусловлена, по-видимому, различной структурой подмембранных участков мышечного волокна.

Среди различных регионов мышечного волокна наиболее жестким является костамер, поскольку его формирует большое количество филаментных белков, собственная жесткость которых весьма существенна.

Наиболее податливым к внешним нагрузкам является мембрана мышечного волокна между костамером и проекцией М-линии, что, вероятнее всего, связано с незначительностью подмембранного каркаса из цитоскелетных внесаркомерных белков.

Следует отметить, что полученные нами результаты впервые отражают механические характеристики мышечного волокна в поперечном направлении с дифференциацией различных областей. Кроме того, в своих измерениях мы ориентировались на глубину продавливания волокна, что позволило определить отдельно жесткость мембраны и внесаркомерного цитоскелета.

Нами показано, что:

– костамер формирует выпуклости поверхности мышечного волокна;

– жесткость костамера и его модуль Юнга составляют 9,10±0,14 пН/нм и 90,1±1,3 кПа соответственно;

– жесткость и модуль Юнга в проекции М-линии составляют 7,26±0,08 пН/нм и 69,2±0,6 кПа соответственно;

– жесткость и модуль Юнга сарколеммы мышечного волокна крысы составляют 6,36±0,13 пН/нм и 54,9±0,8 кПа соответственно.

Формула изобретения

Способ определения жесткости костамера мышечных волокон путем выделения их, снятия силовых кривых и проведения математических расчетов, отличающийся тем, что проводят выделение одиночного мышечного волокна, прикрепляют его к дну жидкостной ячейки атомного силового микроскопа, определяют на воздухе резонансную частоту колебаний, подводят кантилевер к дну жидкостной ячейки, получают в контактном режиме калибровочную силовую кривую и определяют по ней калибровочный коэффициент а (м/А), далее определяют локализацию костамера путем сканирования поверхности волокна, переводят систему в контактный режим и получают силовые кривые на выпуклостях, соответствующих костамеру, по которым находят отклонение кантилевера (А), обобщенную глубину продавливания (м) с последующим вычислением реальной глубины продавливания волокна (h_s) и реальной приложенной к нему силы (F_s) по формулам
h_s=x-y·а,
F_s=y·a·k_c,
где h_s – реальная глубина продавливания, м,
x – обобщенная глубина продавливания, м,
y – измеряемое отклонение кантилевера, А, a – калибровочный коэффициент, м/А),
F_s – реальная приложенная к волокну сила, Н,
k_c – коэффициент жесткости кантилевера, Н/м;
после чего определяют поперечную жесткость костамера k_s, (Н/м) по формуле:
,
где h_s – изменение глубины продавливания волокна, м,
F_s – соответствующее h_s изменение приложенной к волокну силы (Н) и затем строят кривую F_s(h_s) и аппроксимируют ее следующей зависимостью, отражающей решение контактной задачи Герца для скругленного кончика кантилевера
,
где µ_s – коэффициент Пуассона, который, считая клетку несжимаемой, обычно принимают равным 0,5; r_c – радиус скругления кончика кантилевера,
исходя из значения параметра, связывающего приложенную силу и глубину продавливания, а также зная радиус скругления кончика вычисляют модуль Юнга костамера [Е_s]=Па.