Патент на изобретение №2368376

(54) СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИАГРЕГАНТНОЙ, УМЕНЬШАЮЩЕЙ ПОВЫШЕННУЮ ВЯЗКОСТЬ КРОВИ И АНТИТРОМБОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, влияющих на свободнорадикальные процессы, реологию крови, агрегацию тромбоцитов и внутрисосудистое тромбообразование. Предложено использование (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана, известного антиоксидантной активностью, в качестве антиагрегантного, уменьшающего повышенную вязкость крови и антитромбогенного средства. Показана заявленная эффективность средства на модели гипервязкости крови и повышение кровотока в условиях его полной остановки при отсутствии тромбов а артерии на следующие сутки. 4 табл.

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, обладающих антирадикальной, гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью.

Известны средства, обладающие антиоксидантной активностью – аскорбиновая кислота, токоферола ацетат, -каротин [1], эмоксипин [2] и ионол [3]. Наиболее близким соединением (прототипом) является ионол (4-метил-2,6-диизобутилфенол), который относится к пространственно-затрудненным фенолам и обладает выраженной антиоксидантной активностью.

Известны средства, обладающие гемореологической активностью – пентоксифиллин, дигидрокверцетин, танакан [2, 4, 5, 6]. Известны средства, обладающие антитромбоцитарной активностью – пентоксифилин, ацетилсалициловая кислота, тиклопидин, дипиридамол [4, 7]. Известны средства, обладающие антитромбогенной активностью, – пентоксифиллин, ингибиторы циклооксигеназы и аскорбиновая кислота [8, 9, 10].

По этим трем видам активности наиболее близким (прототипом) является пентоксифиллин, обладающий гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью [4, 11, 12].

Задачей изобретения является расширение номенклатуры средств, обладающих антиоксидантной, гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью.

Поставленная задача решается использованием (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан в качестве антиоксидантного, гемореологического, антитромбоцитарного и антитромбогенного средства.

Использование (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана в качестве антиоксидантных, гемореологических, антитромбоцитарных и антитромбогенных средств в литературе не описано.

Ранее данное вещество не использовалось.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве антиоксидантного, гемореологического, антитромбоцитарного и антитромбогенного средства используется (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан. Данные виды активности соединения явным образом не вытекают для специалиста из уровня техники. (3,5-Диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан можно использовать для лечения больных с сердечно-сосудистыми и другими заболеваниями для уменьшения повышенной вязкости крови, спонтанной агрегации эритроцитов, а также снижения агрегационной способности тромбоцитов и внутрисосудистого тромбообразования.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: “новизна”, “изобретательский уровень”, “промышленно применимо”.

Новые свойства (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.

Одной из главных характеристик антиоксидантной активности соединения является константа скорости его взаимодействия с пероксидными радикалами k₇ (антирадикальная активность). Антирадикальную активность (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана в сравнении с ионолом изучали в модельной реакции инициированного азо-бмс-изобутиронитрилом (АИБН, Acros Organics) окисления стирола в хлорбензоле при 50°С с использованием методики, описанной ранее в работах [13, 14, 15].

Скорость окисления стирола измеряли по поглощению кислорода с помощью высокочувствительного капиллярного волюмометра. Период индукции определяли как точку пересечения двух касательных к кинетической кривой, тангенсы углов наклона которых составляют 0.5 и 0.75 от тангенса угла наклона прямой неингибированной реакции [14].

Проводили окисление стирола в присутствии добавки (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана или ионола. По экспериментально полученным данным строили кривую зависимости количества поглощенного кислорода [O₂] от времени t, по которой графически определяли величину периода индукции. Затем строили анаморфозу начального участка кинетической кривой в координатах зависимости [O₂]/[RH] от -ln(1-t/), из тангенса угла наклона которой (tg) определяли отношение k₂/k₇. Абсолютное значение константы скорости k₇ вычисляли, принимая, что при окислении стирола константа скорости продолжения цепей окисления k₂ равна 107.7 М^-1·с^-1 [15]. Измерения проводили в 3-5-кратной повторности.

Среднее значение величины константы скорости k₇ приводится со среднеквадратичной ошибкой.

Рабочие концентрации компонентов в пробе составляли: исследуемого соединения 2.8·10^-4 моль/л, ионола 4.8·10^-4 моль/л, стирола 4.1-6.2 моль/л, [АИБН]=0.07-0.12 моль/л, объем пробы – 0.7 и 2.1 мл.

Эксперименты по изучению гемореологической, антитробоцитарной и антитромбогенной активностей проводили на крысах Вистар.

Эксперименты по изучению гемореологических свойств (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана проводили на 15 крысах-самцах Вистар массой 250-300 г. Животные были разделены на 3 группы: 5 животных получили внутрижелудочно крахмальную слизь (контроль), 5 животных получали внутрижелудочно пентоксифиллин (400 мг/кг) (группа I); 5 животных получили внутрижелудочно (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан (100 мг/кг) (группа II). Соединения и эквиобъемное количество крахмальной слизи (1 мл) вводили внутрижелудочно через зонд за один час до забора крови. Влияние соединений на вязкость крови оценивали с использованием модели гипервязкости крови in vitro. Кровь забирали из общей сонной артерии под эфирным наркозом. В качестве стабилизатора использовали 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9. Вязкость крови измеряли на ротационном вискозиметре АКР-2 в диапазоне скоростей сдвига от 5 с^-1 до 300 с^-1 до и после инкубации проб крови при температуре 20,0±0,4°С в течение 60 минут.

В этой же серии экспериментов было исследовано влияние соединений на агрегацию эритроцитов. Спонтанную агрегацию эритроцитов исследовали с помощью метода [16] в нашей модификации [17]. Для установления интенсивности фотометрического сигнала использовали микроколориметр МКМФ-1, с графической регистрацией на графопостроителе Н306. Критерием агрегационной активности эритроцитов служил полупериод агрегации T_1/2 – время, за которое величина фотометрического сигнала снижается в два раза.

Эксперименты по изучению антитромбоцитарной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана проводили на 15 крысах-самцах Вистар массой 250-280 г. Животные были разделены на 3 группы: 5 животных получили внутрижелудочно крахмальную слизь (контроль), 5 животных получили внутрижелудочно пентоксифиллин (400 мг/кг) (группа III); 5 животных получили внутрижелудочно (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан (100 мг/кг) (группа IV). Соединения и эквиобъемное количество крахмальной слизи (1 мл) вводили внутрижелудочно через зонд за один час до забора крови. Кровь забирали из общей сонной артерии под эфирным наркозом. В качестве стабилизатора использовали 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении с кровью 1:9.

Агрегацию тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме (БТП) определяли нефелометрическим методом по G.V.R. Born [18]. Получение богатой (БТП) и бедной (БеТП) тромбоцитами плазмы и подсчет числа тромбоцитов проводили по стандартному методу [19]. Из проб крови получали БТП и БеТП методом центрифугирования при 400 g и 1800 g соответственно на центрифуге РС-6. В полученной БТП подсчитывали количество тромбоцитов микроскопическим методом при фазовом контрасте в камере Горяева.

Так как в норме число тромбоцитов в крови у крысы колеблется в широких пределах – от 430000 до 1 млн в 1 мм³ – после определения числа тромбоцитов в БТП проводили стандартизацию числа тромбоцитов, для чего БПТ разводили необходимым количеством БеТП до 400±30 тыс. тромбоцитов в 1 мм³ в пробе [20, 21].

Агрегацию тромбоцитов оценивали в стандартизованной плазме на приборе АТ-02, агрегатограммы регистрировали с помощью самописца Recorder 2210.

После добавления индуктора агрегации (АДФ в конечной концентрации 4·10^-6 М) регистрировали изменение уровня оптической плотности БТП. В качестве критерия агрегационной активности тромбоцитов использовали показатель степени агрегации (в %), характеризуемый изменением оптической плотности БТП после добавления в кювету индуктора агрегации. При этом за 100% принимали величину оптической плотности БеТП, а за 0% – величину оптической плотности БТП.

Эксперименты по изучению антитромбогенной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана проводили на 15 крысах-самцах Вистар массой 220-240 г. Животные были разделены на 3 группы: 5 животных получили внутрижелудочно крахмальную слизь (контроль), 5 животных получили внутрижелудочно пентоксифиллин (400 мг/кг) (группа V); 5 животных получили внутрижелудочно (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан (100 мг/кг) (группа VI). Соединения и эквиобъемное количество крахмальной слизи (1 мл) вводили внутрижелудочно через зонд в течение трех суток. На третьи сутки эксперимента – через 1 час после последнего введения животных наркотизировали (тиопентал натрия в дозе 60 мг/кг внутрибрюшинно), выделяли левую общую сонную артерию и воспроизводили модель внутрисосудистого тромбоза [22]. На отпрепарированную сонную артерию накладывали манжеточные датчики и регистрировали величину кровотока по сосуду с помощью электромагнитного расходомера крови MFV-1100 (Nihon Kohden, Япония). Затем под сонную артерию подкладывали полоску фильтровальной бумаги и полоску полиэтиленовой пленки. Сверху на эту артерию накладывали полоску фильтровальной бумаги, на которую наносили 1 каплю 10% раствора FeCl₂. Измеряли величину кровотока в артерии, время от момента нанесения хлорида железа на левую сонную артерию до полной остановки кровотока в ней (время образования тромба). Кроме того, производили расчет снижения кровотока относительно исходной величины кровотока в процентах. По окончании эксперимента (90 мин) крысам ушивали рану. Через сутки под эфирным наркозом производили изъятие сонной артерии, подверженной воздействию хлорида железа, и гравиметрическим методом оценивали массу тромба.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета программного обеспечения “Statistica 6.0”. Рассчитывали среднее значение, стандартную ошибку, для выявления межгрупповых различий использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты исследований антирадикальной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана с использованием методики, описанной выше, представлены в примерах 1-2.

Пример 1. Определение константы скорости взаимодействия (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана с пероксидными радикалами стирола. Определенная величина k₇ составила (11.2±1.3)·10⁴ M^-1·c^-1.

Пример 2. Определение константы скорости взаимодействия ионола с пероксидными радикалами стирола. Определенная величина k₇ составила (2.6±0.6)·10⁴ M^-1·c^-l.

Полученные данные свидетельствуют о наличии у (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана выраженной антирадикальной активности по отношению к пероксидным радикалам стирола, превосходящей таковую у прототипа более чем в 4 раза.

Результаты исследований гемореологической активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана представлены в примерах 3-8.

Пример 3. Инкубирование крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С приводило к значимому повышению вязкости крови при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1, 100 с^-1 и 300 с^-1 на 31%, 19%, 27%, 26% и 14% соответственно (табл.1, контроль).

Таким образом, на модели гипервязкости крови in vitro в контрольной группе отмечено достоверное возрастание вязкости в широком диапазоне скоростей сдвига.

Пример 4. У опытных крыс в группе I вязкость крови до инкубации была достоверно ниже, чем в контроле, при скоростях сдвига 5, 10 и 50 с^-1 на 9%, 16% и 6% соответственно. Инкубирование крови крыс этой группы в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С приводило к повышению вязкости крови при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1, 100 с^-1 и 300 с^-1 на 10%, 14%, 12%, 9% и 7% соответственно. После инкубации вязкость крови при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1, 100 с^-1, 300 с^-1 была ниже, чем в контроле, на 24%, 17%, 17%, 15% и 8% соответственно (табл.1, группа I).

Таким образом, пентоксифиллин снижает вязкость крови при низких скоростях сдвига и на модели гипервязкости крови in vitro ограничивает возрастание вязкости крови в широком диапазоне скоростей сдвига.

Пример 5. У опытных крыс в группе II исходные значения вязкости крови при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1 были ниже на 11%, 8% и 6% соответственно, чем в контроле. Инкубирование крови крыс этой группы в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С приводило к повышению вязкости крови во всем диапазоне исследуемых скоростей сдвига на 4-10%. После инкубирования вязкость крови крыс группы II была ниже, чем в контроле, при скоростях сдвига 5 с^-1, 10 с^-1, 50 с^-1, 100 с^-1 и 300 с^-1, на 29%, 16%, 18%, 15% и 6% соответственно (табл.1, группа II).

Таким образом, (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан снижает вязкость крови при низких скоростях сдвига на модели гипервязкости крови, in vitro ограничивает возрастание вязкости крови в широком диапазоне скоростей сдвига. Выраженность гемореологической активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана в дозе 100 мг/кг сопоставима с таковой у прототипа – пентоксифиллина в дозе 400 мг/кг.

Пример 6. Полупериод агрегации эритроцитов у крыс контрольной группы составил 18,6±1,1 с. Инкубирование крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С приводило к уменьшению полупериода агрегации эритроцитов на 35% (табл.2, контроль).

Таким образом, на модели гипервязкости крови in vitro в контрольной группе установлено уменьшение полупериода агрегации эритроцитов, что свидетельствовало об усилении агрегации эритроцитов.

Пример 7. Полупериод агрегации эритроцитов у крыс группы I составил 19,6±2,1 с. Инкубирование крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С не вызывало значимых сдвигов в значении полупериода агрегации эритроцитов. После инкубации полупериод агрегации эритроцитов был выше на 52% по сравнению с показателем контрольной группы (табл.2, группа I).

Таким образом, на модели гипервязкости крови in vitro пентоксифиллин предотвращает усиление агрегации эритроцитов.

Пример 8. Полупериод агрегации эритроцитов у крыс группы II составил 18,9±1,2 с. Инкубирование крови в течение 60 мин при температуре 20,0±0,4°С не вызывало существенных сдвигов в значении полупериода агрегации эритроцитов. После инкубации полупериод агрегации эритроцитов был выше на 46% по сравнению с показателем контрольной группы (табл.2, группа II).

Таким образом, на модели гипервязкости крови in vitro (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан ограничивает усиление агрегации эритроцитов. Выраженность антиагрегационного влияния на эритроциты (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана в дозе 100 мг/кг сопоставима с таковым у прототипа – пентоксифиллина в дозе 400 мг/кг.

Результаты исследований антитробоцитарной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана представлены в примерах 9-11.

Пример 9. В контрольной группе животных амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 28±1% (табл.3, контроль).

Пример 10. После однократного внутрижелудочного введения пентоксифиллина в дозе 400 мг/кг амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизированной плазме составила 19±1%, что на 32% ниже показателя у крыс контрольной группы (табл.3, группа III).

Таким образом, пентоксифиллин в дозе 400 мг/кг внутрижелудочно однократно обладает выраженной антиагрегантной активностью.

Пример 11. После однократного внутрижелудочного введения (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан в дозе 100 мг/кг амплитуда АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме составила 18±2% (табл.3, группа IV). Амплитуда агрегации тромбоцитов была на 36% ниже, чем в контроле, и была близка к значению показателя у крыс в группе III.

Таким образом, (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан в дозе 100 мг/кг обладает антитромбоцитарной активностью, сравнимой по выраженности с пентоксифиллином в дозе 400 мг/кг.

Результаты исследований антитромбогенной активности (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана представлены в примерах 12-14.

Пример 12. Значение исходного кровотока у крыс контрольной группы составило 5,0±0,4 мл/мин. После аппликации хлорида железа на поверхность сонной артерии у всех животных происходило полное прекращение кровотока по сосуду. Среднее время полной остановки кровотока до нуля составило 20±2 минуты. Масса тромба, определяемая через сутки после аппликации хлорида железа, составила 1,2±0,2 мг (табл.4, контроль).

Пример 13. У опытных крыс группы V, получавших пентоксифиллин в дозе 400 мг/кг внутрижелудочно 1 раз в день в течение 3-х суток, исходное значение кровотока составило 6,3±0,3 мл/мин. К концу периода наблюдения (90 мин с момента аппликации хлорида железа) происходило снижение кровотока в сонной артерии на 31±12%. На следующие сутки в просвете сонной артерии ни у одного животного тромбов не обнаружено (табл.4, группа V).

Таким образом, пентоксифиллин вызывает повышение кровотока по сравнению с контрольной группой и обладает выраженной антитромбогенной активностью.

Пример 14. У опытных крыс группы VI, получавших (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан в дозе 100 мг/кг внутрижелудочно 1 раз в день в течение 3-х суток, исходное значение кровотока составило 7,1±0,7 мл/мин. К концу периода наблюдения (90 мин с момента аппликации хлорида железа) происходило снижение кровотока в сонной артерии на 16±9%. На следующие сутки в просвете сонной артерии ни у одного животного тромбов не обнаружено (табл.4, группа VI).

Таким образом, (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан вызывает повышение кровотока по сравнению с группой контрольных животных и обладает выраженной антитромбогенной активностью.

Предлагаемое изобретение расширяет арсенал средств, обладающих одновременно антиоксидантной, гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью.

Таблица 1
Влияние однократного внутрижелудочного введения пентоксифиллина (400 мг/кг, группа I) и (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана (100 мг/кг, группа II) на вязкость крови до (1) и через 1 ч после инкубации при комнатной температуре (20,0±0,4°C) (2)
Серия опытов	Вязкость крови, мПа·с
5 с-1	10 с-1	50 с-1	100 с-1	300 с-1
1	2	1	2	1	2	1	2	1	2
Контроль	8,5±0,2	11,1±1,1	7,3±0,2	8,6±0,4	5,2**0,1	6,6±0,4	4,7±0,1	5,9±0,3	4,4±0,1	5,0±0,1
Группа I	7,8±0,4*	8,5±0,4*	6,3±0,4*	7,2±0,3*	4,9±0,1	5,5±0,1*	4,6±0,1	5,0±0,1*	4,3±0,1	4,6±0,1*
Группа II	7,6±0,1*	7,9±0,1*	6,7±0,1*	7,2±0,2*	4,9±0,1	5,4±0,1*	4,7±0,1	5,0±0,1*	4,3±0,1	4,7±0,1*
Примечание: – р<0,05 по сравнению с исходными значениями; * – р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Таблица 2
Влияние однократного внутрижелудочного введения пентоксифиллина (400 мг/кг, группа I) и (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана (100 мг/кг, группа II) на агрегацию эритроцитов до (1) и через 1 ч после инкубации при комнатной температуре (20,0±0,4°С) (2)
Серия опытов	Агрегация эритроцитов, с
1	2
Контроль	18,6±1,1	12,1±1,9
Группа I	19,6±2,1	18,4±1,4*
Группа II	18,9±1,2	18,6±1,5*
Примечание: – р<0,05 по сравнению с исходными значениями; * – р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Источники информации

1. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты – М.: Фирма «Слово», 2006. – С.193-196.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. – Харьков: Торсинг, 1998. – С.196, 441.

3. – С.42-48.

4. Габриэлян Э.С., Акопов С.Э. Клетки крови и кровообращение. – Ереван: Айастан, 1985. – С.326-330.

5. Плотников М.Б., Алиев О.И., Маслов М.Ю. и др. Коррекция синдрома повышенной вязкости крови в условиях ишемии мозга у крыс комплексом диквертина и аскорбиновой кислоты / Эксперим. и клинич. фармакология. – 1999. – 6. – С.45-47.

1-2. – С.14-19.

4 – С.21-24.

5(18). – С.1261-1267.

6(32). – С.1302-1309.

16. Габриэлян Э.С., Акопов С.Э. Клетки крови и кровообращение. – Ереван: Айастан, 1985. – С.71-78.

3. – С.457-458.

4832. – P. 927-929.

19. Баркаган З.С., Момот А.П. Основные методы лабораторной диагностики нарушений системы гемостаза – Барнаул, 1998. – С.10-16.

21. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные. – Киев, 1974. – С.200.

9. – С.821-822.

Формула изобретения

Применение (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана в качестве средства, обладающего антиагрегантной, уменьшающей повышенную вязкость крови и антитромбогенной активностью.