Патент на изобретение №2367450

(54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЯЗВЕННОГО ПРОКТОСИГМОИДИТА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно гастроэнтерологии, и может быть использовано для лечения язвенного проктосигмоидита. Способ осуществляют следующим образом. В прямую кишку в микроклизмах объемом 30-50 мл 1-3 раза в день вводят кондиционную среду мезенхимальных стволовых клеток в стадии стационарного роста, в течение 10-14 дней. Использование изобретения позволяет уменьшить кровоточивость, эрозии и язвы за счет продуктов жизнедеятельности мезенхимальных стволовых клеток.

Изобретение относится к медицине и может быть применено в качестве способа лечения язвенного проктосигмоидита.

Известен способ лечения воспалительных заболеваний кишечника преднизолоном (1 – P.Korrea et al. J. Natl. Cancer Inst. 2000, 92, 1881-1888). Способ принят в качестве аналога.

Известен способ лечения воспалительных заболеваний кишечника, заключающийся в том, что при резистентной к стероидам болезни Крона назначают метотрексат, что позволяет снизить дозы преднизолона в 78% случаев. Данный способ принят за прототип (2 – R.Y.Chang et al. Aliment. Pharmacol. Ther. 2001, 15; 35-44).

Однако применение метотрексата приводит к ряду побочных действий, в частности к гингивитам, фарингитам, стоматитам, язвам и желудочно-кишечным кровотечениям; у ряда больных возникает непереносимость препарата.

Целью настоящего изобретения является повышение эффективности лечения язвенного проктосигмоидита.

Технический результат достигается тем, что в качестве лекарственного препарата вводят кондиционную среду мезенхимальных стволовых клеток в стадии стационарного роста, в прямую кишку, в микроклизмах объемом 30-50 мл 1-3 раза в день, в течение 10-14 дней.

Способ осуществляется следующим образом.

Получают кондиционную среду мезенхимальных стволовых клеток. Клеточный материал в виде клеток костного мозга получают при пункции подвздошной кости человека под местной анестезией 0,5% раствором новокаина объемом 0,5-1,0 мл строго в стерильных условиях, при клеточности полученного материала порядка 5×10⁷ клеток, и помещают в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатой температуре супернатант отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывали в среде 199 («Sigma», USA), центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды служила содержащая солевой раствор и аминокислоты среда RPMI-1640 (“Sigma”, USA), с добавлением пенициллина (до 100 ЕД/мл), амфотерицина (до 100 нг/мл), стрептомицина (до 100 мкг/мл), L-глютамина (2-4 мМ) и 20% эмбриональной телячьей сыворотки.

Культивирование проводилось в пластиковых флаконах Карреля («Sigma», USA), с площадью дна 25 см², в которые вносили 5×(10⁶-10⁷) клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Для очищения культуры от кроветворных клеток, увеличения общего количества мезенхимальных клеток и достижения сливного (конфлюентного) монослоя культуру пересевали 2-4 раза. В большинстве случаев 3-х раз было вполне достаточно для избавления от гемопоэтических клеток, сохранения в культуре только мезенхимальных стволовых клеток и накопления достаточного количества продуктов их жизнедеятельности. Культуральные флаконы продували газовой смесью, содержащей 4-6% углекислого газа (остальное воздух), каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. Среду меняли каждые 3-4 суток по мере ее закисления размножающимися стволовыми клетками. Культуральные флаконы в процессе роста содержались в обычном термостате при 37°С. Стадию стационарного роста стабильной линии мезенхимальных стволовых клеток, когда наступает созревание кондиционной среды, оценивали посредством наблюдения за образованием конфлюентного слоя клеток с помощью инвертированного микроскопа, и она достигалась на 10-12 сутки после посева очищенной от гемопоэтических клеток суспензии мезенхимальных клеток. В это время количество клеток, находящихся в стадии пролиферативного покоя G_о, составляет по данным анализа в проточном цитофлюориметре примерно 95-98%, в то время как на 5-7 сутки роста культуры при отсутствии конфлюэнтного роста клеток их содержание в суспензии меньше в 4-5 раз.

Кондиционную среду собирали из выросшей к 10-12 суткам культуры в стерильную посуду. Ее использовали непосредственно по назначению или хранили в течение продолжительного времени в определенных условиях. Например, если предполагалось использование кондиционной среды в течение одной недели, то ее хранили в холодильнике при температуре около 3-4°С. При сроках использования более чем через одну неделю, ее замораживали и хранили при температуре -20°С и ниже. Перед употреблением среду размораживали. Таким образом, к концу 5-6 недели от начала культивирования клеток костного мозга человека получали популяцию мезенхимальных стволовых клеток человека достаточного количества (1-2)×10⁸ клеток для аутологичной трансплантации и одновременно получали до 800 мл надлежащего качества кондиционной среды.

У больных с язвенным проктосигмоидитом выясняют наличие примеси крови в стуле в виде отдельных мазков и сгустков, учащение стула до 3-4 раз в сутки, наличие схваткообразных болей в левой половине живота, снижение аппетита, ложные позывы на дефекацию. В некоторых случаях больные страдают тяжелыми запорами. В клиническом анализе крови отмечается выраженная анемия со снижением гемоглобина до 40-50 ед., увеличение СОЭ до 40 мм/ч и выше, умеренная диспротеинемия.

При сигмоскопическом исследовании находят гиперемию и отек слизистой оболочки толстой кишки, контактную кровоточивость, эрозии и небольшие поверхностные язвы.

При рентгенологическом исследовании больных с язвенным проктосигмоидитом обнаруживают зазубренность контуров, деформацию гаустр; в некоторых случаях – уменьшение просвета и укорочение толстой кишки со сглаженностью ее физиологических изгибов.

Больные страдают синдромом мальабсорбции, в связи с чем развиваются безбелковые отеки, анемия, возникает дефицит веса.

Клинические симптомы определяются локализацией, протяженностью воспалительного процесса и морфологическими особенностями воспаления. Приступы болей в животе носят схваткообразный характер и возникают перед актом дефекации и связаны с повышенным напряжением кишечной стенки во время мышечного сокращения.

Проводят лечение кондиционной средой мезенхимальных стволовых клеток, которую вводят в прямую кишку в микроклизмах объемом 30-50 мл 1-3 раза в день, в течение 10-14 дней.

Контрольное эндоскопическое исследование после лечения выявляет снижение гиперемии и отеки слизистой оболочки ситовидной и прямой кишки, отсутствие контактной кровоточивости, эрозий и язв.

При рентгенологическом исследовании больных с язвенным проктосигмоидитом после лечения обнаруживают восстановление просвета кишки и ее длины, восстановление физиологических изгибов.

Исчезают безбелковые отеки, повышается уровень гемоглобина, нормализуется вес.

Способ далее поясняют примеры его реализации.

Пример 1

Больная М., 32 лет, поступила с диагнозом: язвенный проктосигмоидит. Предъявляет жалобы на примесь крови в стуле в виде отдельных сгустков и склонность к запорам, наличие схваткообразных болей в левой половине живота. В клиническом анализе крови: гемоглобин 40 ед., СОЭ 40 мм/ч, умеренная диспротеинемия. Развиваются безбелковые отеки и возникает дефицит веса: больная потеряла 8 кг за последние полгода.

Получают кондиционную среду мезенхимальных стволовых клеток. Клеточный материал в виде клеток костного мозга получают при пункции подвздошной кости человека под местной анестезией 0,5% раствором новокаина объемом 0,5 мл строго в стерильных условиях, при клеточности полученного материала порядка 5×10⁷ клеток и помещают в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатой температуре супернатант отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывали в среде 199 («Sigma», USA), центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды служила содержащая солевой раствор и аминокислоты среда RPMI-1640 (“Sigma”, USA), с добавлением пенициллина (до 100 ЕД/мл), амфотерицина (до 100 нг/мл), стрептомицина (до 100 мкг/мл), L-глютамина (2-4 мМ) и 20% эмбриональной телячьей сыворотки.

Культивирование проводилось в пластиковых флаконах Карреля («Sigma», USA), с площадью дна 25 см², в которые вносили 5×10⁶ клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Для очищения культуры от кроветворных клеток, увеличения общего количества мезенхимальных клеток и достижения сливного (конфлюентного) монослоя культуру пересевали 2 раза. Культуральные флаконы продували газовой смесью, содержащей 4% углекислого газа (остальное воздух), каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. Среду меняли каждые 3 суток по мере ее закисления размножающимися стволовыми клетками. Культуральные флаконы в процессе роста содержались в обычном термостате при 37°С. Стадию стационарного роста стабильной линии мезенхимальных стволовых клеток, когда наступает созревание кондиционной среды, оценивали посредством наблюдения за образованием конфлюентного слоя клеток с помощью инвертированного микроскопа, и она достигалась на 10 сутки после посева очищенной от гемопоэтических клеток суспензии мезенхимальных клеток. В это время количество клеток, находящихся в стадии пролиферативного покоя G_о, составляет по данным анализа в проточном цитофлюориметре примерно 95%, в то время как на 5 сутки роста культуры при отсутствии конфлюэнтного роста клеток их содержание в суспензии меньше в 4 раза.

Кондиционную среду собирали из выросшей к 10 суткам культуры в стерильную посуду. Ее использовали непосредственно по назначению или хранили в течение продолжительного времени в определенных условиях. Например, если предполагалось использование кондиционной среды в течение одной недели, то ее хранили в холодильнике при температуре около 3°С. При сроках использования более чем через одну неделю, ее замораживали и хранили при температуре -20°С и ниже. Перед употреблением среду размораживали. Таким образом, к концу 5 недели от начала культивирования клеток костного мозга человека получали популяцию мезенхимальных стволовых клеток человека достаточного количества 1×10⁸ клеток для аутологичной трансплантации и одновременно получали 700 мл надлежащего качества кондиционной среды.

При сигмоскопическом исследовании находят отек слизистой оболочки сигмы и прямой кишки, контактную кровоточивость и эрозии.

При рентгенологическом исследовании обнаруживают зазубренность контуров, уменьшение просвета и укорочение толстой кишки со сглаженностью ее физиологических изгибов.

Приступы болей в животе носят схваткообразный характер и возникают перед актом дефекации, и связаны с повышенным напряжением кишечной стенки во время мышечного сокращения.

Проводят лечение кондиционной средой мезенхимальных стволовых клеток, которую вводят в прямую кишку в микроклизмах объемом 30 мл 1 раз в день, в течение 10 дней.

Контрольное эндоскопическое исследование после лечения выявляет снижение отека слизистой оболочки сигмовидной и прямой кишки, отсутствие контактной кровоточивости, единичные эрозии.

При рентгенологическом исследовании больных с язвенным проктосигмоидитом после лечения обнаруживают увеличение просвета кишки и ее длины, восстановление физиологических изгибов.

Исчезают болевой синдром, безбелковые отеки, повышается уровень гемоглобина, нормализуется вес.

Пример 2

Больной З., 39 лет, поступил с диагнозом: язвенный проктосигмоидит. Предъявляет жалобы на схваткообразные боли в левой половине живота. В клиническом анализе крови: гемоглобин 45 ед., СОЭ 50 мм/ч, умеренная диспротеинемия, потеря веса 5 кг за последние три месяца.

У больного выясняют наличие примеси крови в стуле в виде отдельных сгустков, стул 1 раз в трое суток, наличие схваткообразных болей в левой половине живота, снижение аппетита, ложные позывы на дефекацию.

При сигмоскопическом исследовании находят гиперемию и отек слизистой оболочки толстой кишки, эрозии и небольшие поверхностные язвы.

При рентгенологическом исследовании обнаруживают деформацию гаустр, уменьшение просвета и укорочение толстой кишки.

Получают кондиционную среду мезенхимальных стволовых клеток. Клеточный материал в виде клеток костного мозга получают при пункции подвздошной кости человека под местной анестезией 0,5% раствором новокаина объемом 1,0 мл строго в стерильных условиях, при клеточности полученного материала порядка 5×10⁷ клеток и помещают в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 2 часов при комнатной температуре супернатант отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывали в среде 199, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды служила содержащая солевой раствор и аминокислоты среда RPMI-1640, с добавлением пенициллина (до 100 ЕД/мл), амфотерицина (до 100 нг/мл), стрептомицина (до 100 мкг/мл), L-глютамина (2-4 мМ) и 20% эмбриональной телячьей сыворотки.

Культивирование проводилось в пластиковых флаконах Карреля, с площадью дна 25 см², в которые вносили 5×10⁷ клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Для очищения культуры от кроветворных клеток, увеличения общего количества мезенхимальных клеток и достижения сливного (конфлюентного) монослоя культуру пересевали 4 раза. Культуральные флаконы продували газовой смесью, содержащей 6% углекислого газа (остальное воздух), каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. Среду меняли каждые 4 суток по мере ее закисления размножающимися стволовыми клетками. Культуральные флаконы в процессе роста содержались в обычном термостате при 37°С. Стадию стационарного роста стабильной линии мезенхимальных стволовых клеток, когда наступает созревание кондиционной среды, оценивали посредством наблюдения за образованием конфлюентного слоя клеток с помощью инвертированного микроскопа, и она достигалась на 12 сутки после посева очищенной от гемопоэтических клеток суспензии мезенхимальных клеток. В это время количество клеток, находящихся в стадии пролиферативного покоя G_o, составляет по данным анализа в проточном цитофлюориметре примерно 98%, в то время как на 7 сутки роста культуры при отсутствии конфлюэнтного роста клеток их содержание в суспензии меньше в 5 раз.

Кондиционную среду собирали из выросшей к 12 суткам культуры в стерильную посуду. Ее использовали непосредственно по назначению или хранили в течение продолжительного времени в определенных условиях. Например, если предполагалось использование кондиционной среды в течение одной недели, то ее хранили в холодильнике при температуре около 4°С. При сроках использования более чем через одну неделю, ее замораживали и хранили при температуре -20°С и ниже. Перед употреблением среду размораживали. Таким образом, к концу 6 недели от начала культивирования клеток костного мозга человека получали популяцию мезенхимальных стволовых клеток человека достаточного количества 2×10⁸ клеток для аутологичной трансплантации и одновременно получали до 800 мл надлежащего качества кондиционной среды.

Проводят лечение кондиционной средой стволовых клеток, которую вводят в прямую кишку в микроклизмах объемом 50 мл 3 раза в день, в течение 14 дней.

Контрольное эндоскопическое исследование после лечения выявляет снижение гиперемии и отека слизистой оболочки сигмовидной и прямой кишки, отсутствие эрозий и язв.

При рентгенологическом исследовании больных с язвенным проктосигмоидитом после лечения обнаруживают восстановление просвета кишки и ее длины, и рельефа слизистой.

Пример 3

Больной Ц., 28 лет, поступил с диагнозом проктосигмоидит. Предъявляет жалобы на примесь крови в стуле, склонность к запорам, наличие схваткообразных болей в левой половине живота. В клиническом анализе крови: гемоглобин 43 ед., СОЭ 47 мм/ч. Развиваются безбелковые отеки и возникает дефицит веса: больной потерял 10 кг за последние полгода.

При сигмоскопическом исследовании находят гиперемию и отек слизистой оболочки толстой кишки, контактную кровоточивость, эрозии и небольшие поверхностные язвы.

При рентгенологическом исследовании обнаруживают зазубренность контуров, деформацию гаустр; в некоторых случаях – уменьшение просвета и укорочение толстой кишки со сглаженностью ее физиологических изгибов.

Больной страдает синдромом мальабсорбции с развитием безбелковых отеков, анемии, дефицита веса.

Клинические симптомы определяются локализацией, протяженностью воспалительного процесса и морфологическими особенностями воспаления.

Получают кондиционную среду мезенхимальных стволовых клеток. Клеточный материал в виде клеток костного мозга получают при пункции подвздошной кости человека под местной анестезией 0,5% раствором новокаина объемом 0,7 мл строго в стерильных условиях, при клеточности полученного материала порядка 5×10⁷ клеток и помещают в пробирки с гепарином (100 ЕД/мл пунктата). После отстаивания эритроцитов в течение 1,5 часов при комнатой температуре супернатант отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки отмывали в среде 199, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендировали в ростовой среде. В качестве ростовой среды служила содержащая солевой раствор и аминокислоты среда RPMI-1640, с добавлением пенициллина (до 100 ЕД/мл), амфотерицина (до 100 нг/мл), стрептомицина (до 100 мкг/мл), L-глютамина (3 мМ) и 20% эмбриональной телячьей сыворотки.

Культивирование проводилось в пластиковых флаконах Карреля с площадью дна 25 см², в которые вносили 7×10⁶ клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Для очищения культуры от кроветворных клеток, увеличения общего количества мезенхимальных клеток и достижения сливного (конфлюентного) монослоя культуру пересевали 3 раза. Культуральные флаконы продували газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа (остальное воздух), каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. Среду меняли каждые 3 суток по мере ее закисления размножающимися стволовыми клетками. Культуральные флаконы в процессе роста содержались в обычном термостате при 37°С. Стадию стационарного роста стабильной линии мезенхимальных стволовых клеток, когда наступает созревание кондиционной среды, оценивали посредством наблюдения за образованием конфлюентного слоя клеток с помощью инвертированного микроскопа, и она достигалась на 11 сутки после посева очищенной от гемопоэтических клеток суспензии мезенхимальных клеток. В это время количество клеток, находящихся в стадии пролиферативного покоя G_o, составляет по данным анализа в проточном цитофлюориметре примерно 96%, в то время как на 6 сутки роста культуры при отсутствии конфлюэнтного роста клеток их содержание в суспензии меньше в 4,5 раза.

Кондиционную среду собирали из выросшей к 11 суткам культуры в стерильную посуду. Ее использовали непосредственно по назначению или хранили в течение продолжительного времени в определенных условиях. Например, если предполагалось использование кондиционной среды в течение одной недели, то ее хранили в холодильнике при температуре около 3,5°С. При сроках использования более чем через одну неделю, ее замораживали и хранили при температуре -20°С и ниже. Перед употреблением среду размораживали. Таким образом, к концу 6 недели от начала культивирования клеток костного мозга человека получали популяцию мезенхимальных стволовых клеток человека достаточного количества 1,5×10⁸ клеток для аутологичной трансплантации и одновременно получали 800 мл надлежащего качества кондиционной среды.

Проводят лечение кондиционной средой стволовых клеток, которую вводят в прямую кишку в микроклизмах объемом 40 мл 2 раза в день в течение 12 дней.

Контрольное эндоскопическое исследование после лечения выявляет снижение гиперемии и отека слизистой оболочки сигмовидной и прямой кишки, отсутствие контактной кровоточивости, эрозий и язв.

При рентгенологическом исследовании после лечения обнаруживают восстановление просвета кишки и ее длины, восстановление рельефа слизистой.

Исчезают безбелковые отеки, повышается уровень гемоглобина, нормализуется вес.

Проведено лечение 23 больных с язвенным проктосигмоидитом. Результаты показали достижение цели изобретения – повышение эффективности лечения язвенного проктосигмоидита.

Формула изобретения

Способ лечения язвенного проктосигмоидита путем введения лекарственного препарата, отличающийся тем, что в качестве лекарственного препарата вводят кондиционную среду мезенхимальных стволовых клеток в стадии стационарного роста в прямую кишку в микроклизмах объемом 30-50 мл 1-3 раза в день в течение 10-14 дней.