Патент на изобретение №2366955
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВРЕМЕНИ САМОСБОРКИ ФИБРИН-МОНОМЕРА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике. Предложен способ определения времени самосборки фибрин-мономера. Способ может быть использован для исследования крови при нарушениях в системе гемостаза. Он включает определение времени свертывания при использовании тромбина, добавление мочевины в концентрации 180 г/л. В способе используют тромбин активностью 4-6 с. Предлагаемый способ позволяет оценить как замедление, так и ускорение самосборки фибрин-мономера в соответствующих типовых клинических ситуациях. Способ обеспечивает также повышение точности определения времени самосборки фибрин-мономера. 4 табл.
Изобретение относится к области медицины, в частности к лабораторной диагностике, и может быть использовано для исследования крови при нарушениях в системе гемостаза. Система свертывания крови характеризуется как каскад ферментативных реакций с превращением на конечном этапе коагуляции фибриногена под влиянием тромбина в фибрин. Конечный этап свертывания включает ряд ферментативных и неферментативных реакций. Вначале от Удлинение времени на конечном этапе свертывания, связанные с дефектами отделения фибринопептидов А и/или В от фибриногена и взаимодействием фибрин-мономеров между собой (самосборка фибрин-мономера), характерны для врожденных или приобретенных дисфибриногенемий, при которых часто наблюдается геморрагический синдром. С другой стороны, ускорение времени самосборки фибрин-мономера может быть одной из причин гиперкоагуляционного синдрома, ведущего к внутрисосудистому свертыванию крови. Известен способ определения активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), основанный на измерении времени свертывания плазмы крови человека при ее рекальцификации в условиях стандартизированной контактной и фосфолипидной активации свертывания (Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. Издание 2-е дополненное. – М.: «Ньюдиамед», 2001. – С.79-81). Недостатком известного способа является влияние на АПТВ дефицита факторов коагуляции (XII, XI, X, IX, VIII, V, II), наличия их ингибиторов и присутствия в плазме крови антикоагулянтов прямого действия (гепарина и др.). Кроме того, известный способ мало чувствителен к нарушениям самосборки фибрин-мономера и редко является показательным в этом отношении. Известен способ определения продолжительности самосборки фибрина в плазме, включающий обработку фибриногена тромбином непосредственно в плазме в присутствии мочевины, добавление буфера с низкой ионной силой и последующее определение времени самосборки фибрина (авторское свидетельство SU 1210094, опубл. 07.02.1986 г., реферат и описание изобретения). Определяют долю продолжительности самосборки фибрина в общей продолжительности фибринообразования. Реактивы. 1. Мочевина, 40% на 0,02М ацетатном буфере с рН 5,2 2. Раствор тромбина 0,1%, 1% в 0,14М хлориде натрия 3. Боратный буфер 0.0075М, рН – 7,6 Материал для исследования. Цитратная плазма крови. Ход определения. К 0,2 мл исследуемой плазмы добавляют 0,2 мл 40% раствора мочевины и 0,2 мл 0,1% раствора тромбина. Смешивают и оставляют на водяной бане при +37°С на 10 мин. 0,1 мл смеси после экспозиции переносят в пробирку, куда предварительно наливают 0,3 мл боратного буфера. В момент внесения включают секундомер, выключая его при появлении сгустка, регистрируя продолжительность самосборки фибрина. Показания секундомера, например 16,3 с. В пробирку на водяной бане при +37°С вносят 0,3 мл боратного буфера, добавляют 0,033 мл 40% раствора мочевины и 0,033 мл исследуемой плазмы, все смешивают. К смеси добавляют 0,033 мл 1% раствора тромбина, немедленно включают секундомер и отмечают момент образования сгустка, регистрируя общую продолжительность фибринообразования. Показания секундомера, например 58,7 с. Чтение результатов. Расчет доли самосборки в общей продолжительности фибринообразования в исследуемой плазме: (16,3:58,7)×100=27,7%. К недостаткам способа определения продолжительности самосборки фибрина в плазме следует отнести: 1. Невозможность использования тромбина, стандартного по активности. 2. Невозможность проведения коагулометрического исследования. 3. Трудоемкость и длительность теста. 4. Низкая точность способа. Заявляемый способ лишен этих недостатков: тест легко выполняется на коагулометрах различной конструкции с использованием стандартного по активности тромбина, имеет более высокую точность при оценке как замедления, так и укорочения времени самосборки в плазме больных с различными видами нарушений гемостаза. Авторами разработан высокоэффективный и высокоточный способ определения времени самосборки фибрин-мономера, позволяющий определять как удлинение, так и укорочение времени самосборки фибрин-мономера. Техническим результатом заявляемого способа является повышение точности определения времени самосборки фибрин-мономера. Технический результат достигается тем, что в реагирующую смесь вводят мочевину в концентрации 150-250 г/л и используют тромбин активностью 40-60 NIH/мл или 4-6 с. Способ осуществляют следующим образом. Реактивы и оборудование: 1. Цитрат натрия, трехзамещенный, 3,8% раствор, получают растворением 3,8 г цитрата натрия в 100 мл дистиллированной воды. 2. Тромбин человека (лиофильно высушенный), 500 NIH, фирма «Технология-Стандарт», Россия. 3. Буфер трис-НСl концентрированный (20:1), 1,0 М, 5 мл, рН 7,3-7,4, фирма «Технология-Стандарт», Россия. 4. Мочевина, осч, фирма «Merck», Германия. 5. Физиологический (0,9%) раствор хлорида натрия. 6. Дистиллированная вода. 7. Центрифуга ОПН-8. 8. Коагулометр Минилаб-701 фирмы Юнимед, Россия. 9. Пробирки стеклянные объемом 20 мл. 10. Цилиндр стеклянный, мерный, на 100 мл. Приготовление реактивов. 1. Разведение тромбина: во флакон с лиофильно высушенным тромбином добавляют 10,0 мл физиологического раствора хлорида натрия и при легком покачивании растворяют реагент в течение 5 мин. 2. Приготовление рабочего буферного раствора, содержащего мочевину: концентрированный буфер в объеме 2,0 мл и навеску мочевины (18 г) вносят в мерный цилиндр и общий объем доводят дистиллированной водой до 100 мл. В результате получают рабочий буферный раствор следующего состава – трис-HCl 0,01 М, рН 7,3-7,4, содержащий мочевину в концентрации 180 г/л. Подготовка исследуемой плазмы больного и пула контрольной нормальной плазмы крови (взятой у здоровых людей). Кровь получают из локтевой вены самотеком через иглу в пластиковую пробирку, содержащую 0.1М раствор цитрата натрия (соотношение крови и цитрата 9:1). Кровь центрифугируют 5 мин при скорости вращения 1000 об./мин (200g). Полученную богатую тромбоцитами плазму повторно центрифугируют в течение 20 минут при 4000 об./мин (1200g). Полученную бедную тромбоцитами плазму используют для проведения исследования. Для приготовления пула контрольной нормальной плазмы в равной пропорции смешивают образцы бедной тромбоцитами плазмы от 8-10 здоровых людей. Ход определения В кювету коагулометра вносят 0,1 мл исследуемой плазмы и выдерживают в термостатируемой ячейке 1 мин при +37°С. Затем добавляют 0,05 мл рабочего буферного раствора, содержащего мочевину в концентрации 180 г/л, и инкубируют там же при +37°С в течение 1 мин. Переносят кювету в измерительный канал, затем добавляют 0,05 мл раствора тромбина, тотчас запускают измерительный канал и регистрируют время свертывания в конечном этапе. Оценка полученных результатов. По результатам обследования здоровых людей (42 наблюдения) время свертывания в конечном этапе составляет 24,5-37,8 с (Х=30,7; Удлинение времени самосборки фибрин-мономера свыше указанного верхнего предела свидетельствует о врожденной или приобретенной дисфибриногенемии, либо тормозящем влиянии ингибиторов самосборки фибрин-мономера (продукты деградации фибрина – D-димер, парапротеины). Укорочение времени самосборки фибрин-мономера показывает на наличие тромбогенного сдвига на конечном этапе свертывания. Апробация предлагаемого способа. Апробация заявляемого способа проведена на 25 больных с удлинением времени свертывания на конечном этапе (I группа), в том числе с геморрагическими мезенхимальными дисплазиями (14), с болезнью Виллебранда (7), циррозами печени (4), а также на 27 больных (II группа) с укорочением времени самосборки фибрин-мономера при гиперкоагуляционных состояниях, а именно с гематогенными тромбофилиями (11), тяжелыми гестозами последнего триместра беременности (9), септическими состояниями (7). Результаты обследования больных с нарушениями конечного этапа свертывания по предлагаемому способу представлены в таблице 1. Из таблицы следует, что предлагаемый способ позволяет оценить как замедление, так и ускорение самосборки фибрин-мономера в соответствующих типовых клинических ситуациях. Необходимо отметить, что заявленный способ имеет существенные отличия от известного SU 1210094, а именно использование стандартизированного по коагуляционной активности тромбина, значительное сокращение времени проведения анализа, возможность коагулометрического проведения исследования, повышение точности результатов. В частности: 1. Повышение точности заявленного способа достигается использованием тромбина стандартной активности 4-6 с (или 40-60 NIH/мл). Описываемая в способе-прототипе активность применяемого тромбина (0,1% или 0,1 г/100 мл) не может быть стандартизирована, поскольку тромбин представляет собой фермент, активность которого трудно сопоставить с его весом в разных партиях данного реагента различных производителей. Для пояснения выбора диапазона активности используемого тромбина приводим таблицу 2, в которой показано влияние активности тромбина на результат в заявляемом способе. В ней приведены средние данные по результатам 10-кратного повтора оценки времени самосборки фибрин-мономера. Как видно из таблицы 2, оптимальной активностью тромбина в заявляемом способе является диапазон от 40 до 60 NIH/мл. Более низкая активность тромбина (менее 40 NIH/мл) дает неустойчивые результаты и удлиняет время исследования. Применение активности тромбина свыше 60 NIH/мл экономически нецелесообразно. 2. Кроме того, в заявляемом способе время, необходимое для выполнения анализа, составляет 2,5-3 мин, в то время как способ-прототип требует для своего выполнения 15-17 мин, т.е. в среднем в 5,8 раз меньше. 3. Принято проводить оценку свертывания крови или полученной из нее плазмы с использованием коагулометров. Оценка результатов в заявляемом способе может проводиться на коагулометре любой конструкции. В то же время определение времени свертывания в способе-прототипе выполняется лишь мануально и не улавливается коагулометрически из-за низкой концентрации фибриногена в оцениваемой смеси («крошковидное» свертывание). Последнее обусловлено высоким, в 12 раз, разведением плазмы в ходе выполнения анализа по способу-прототипу. В заявляемом способе плазма в ходе выполнения анализа разводится в 2 раза. Кратно приведенным разведениям снижается количество необходимого субстрата свертывания для тромбина – фибриногена. 4. При выполнении заявляемого способа определения времени самосборки фибрин-мономера повышается точность определений по сравнению со способом-прототипом. В таблице 3 показано, что коэффициент вариации результатов в заявляемом способе более, чем в 3 раза ниже аналогичного показателя в способе-прототипе, и составляет 4,4%. Расчет коэффициента вариации получаемых результатов представлен в предлагаемом способе коагулометрически и способе-прототипе мануально. Обоснование необходимого диапазона концентрации мочевины для оценки конечного этапа свертывания в предложенном способе. Для выбора необходимой концентрации мочевины при определении времени самосборки фибрин-мономера использовали образцы буферного раствора мочевины с концентрацией от 50 до 350 г/л (таблица 4). Установлено, что оптимальные ее концентрации лежат в диапазоне от 150,0 до 250,0 г/л. Снижение концентрации мочевины ниже 150,0 г/л приводит к тому, что время образования сгустка укорачивается до 17,1-19,0 с и менее и достоверно не отличается у больных разных групп. С другой стороны, использование концентрации мочевины свыше 250,0 г/л приводит к значительному удлинению времени свертывания и снижению воспроизводимости метода. Для определения оптимального диапазона концентрации мочевины в тест-системе при определении времени самосборки фибрин-мономера применили соотношение С=К/Б, где С – соотношение; К – время самосборки фибрин-мономера в контрольной нормальной пулированной плазме; Б – время самосборки фибрин-мономера в плазме больного. Из исследований, приведенных в таблице 3, можно наблюдать, что необходимый диапазон концентраций мочевины в тест-системе составляет 150-250 г/л, так как именно в этом диапазоне концентраций мочевины соотношения остаются неизменными и имеют диагностическое значение. Для оценки воспроизводимости заявляемого способа использовали коэффициент вариации CV(%). Коэффициент вариации способа при исследовании в разные дни проведения исследований не превышает 8,5%. Таким образом, заявляемый способ определения времени самосборки фибрин-мономера обладает высокой точностью и позволяет диагностировать врожденные или приобретенные дисфибриногенемии, при которых часто наблюдается геморрагический синдром, а также выявлять гиперкоагуляционный синдром, ведущий к внутрисосудистому свертыванию крови.
Формула изобретения
Способ определения времени самосборки фибрин-мономера, включающий определение времени свертывания при использовании тромбина и мочевины, отличающийся тем, что время свертывания оценивают на коагулометре при последовательном смешивании 0,1 мл исследуемой плазмы, 0,05 мл раствора мочевины в концентрации 180 г/л, инкубации при температуре 37°С в течение 1 мин и добавлении 0,05 мл раствора тромбина, активностью 4-6 с или 40-60 NIH/мл.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||