Патент на изобретение №2366712

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ, АЛЬФА-АМИЛАЗЫ И ГЛЮКОАМИЛАЗЫ

(57) Реферат:

Способ предусматривает гидролиз крахмалсодержащего сырья, добавление к полученному гидролизату минеральные солей, ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger. Гидролиз осуществляют ферментным препаратом бактериальной -амилазой при повышенной температуре и избыточном давлений. В качестве крахмалсодержащего сырья используют предварительно выдержанную в воде при 20-25°C в течение 10-12 ч рисовую муку в количестве 205,3-235,7 г и ржаную муку в количестве 232,0-290,6 г. При этом в полученной суспензии рисовой муки обеспечивают содержание углерода и азота в соотношении (20,0-23,0):1, а в суспензии ржаной муки (14,0-16,0):1 соответственно. Ферментный препарат используют в количестве до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода 35-40%. Способ позволяет повысить выход -амилазы и глюкоамилазы при сохранении высокого выхода лимонной кислоты. Конверсия сахаров в лимонную кислоту составляет 86,7-93,2%. Активность -амилазы и глюкоамилазы составляет 4,5-6,2 единиц А.С/см³ и 160-180 единиц Гл.С/см³ соответственно. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: -амилазы и глюкоамилазы, которые используются в хлебопечении, пивоварении, крахмалопаточной промышленности, медицине, т.е. во всех процессах, требующих гидролиза поли- и олигосахаридов.

Известен способ получения лимонной кислоты, включающий гидролиз крахмала препаратом бактериальной -амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении до достижения значения декстрозного эквивалента гидролизата крахмала не менее 30%, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger. В качестве минеральных солей используют соли в виде сульфатов меди (II), цинка, кобальта (II). К гидролизату крахмала дополнительно добавляют органический источник азота в количестве, обеспечивающем содержание в среде углерода и азота в соотношении (65-75):1 соответственно /1/.

Недостатком вышеуказанного способа является невысокий выход ос-амилазы и глюкоамилазы.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения лимонной кислоты, -амилазы и глюкоамилазы, включающий гидролиз крахмалсодержащего сырья ферментным препаратом бактериальной -амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger /2/.

Недостатком вышеуказанного способа является невысокий выход -амилазы и глюкоамилазы.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение выхода -амилазы и глюкоамилазы при сохранении высокого выхода лимонной кислоты.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что в способе получения лимонной кислоты, -амилазы и глюкоамилазы, включающем гидролиз крахмалсодержащего сырья ферментным препаратом бактериальной -амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом – кислотообразователем Aspergillus niger, в качестве крахмалсодержащего сырья используют рисовую в количестве 205,3-235,7 г или ржаную муку в количестве 232,0-290,6 г, предварительно выдержанную в воде, при температуре 20-25°С в течение 10-12 часов, при этом содержание в полученной суспензии рисовой муки углерода и азота в соотношении (20-23):1, а в суспензии ржаной муки (14-16,0):1 соответственно, ферментный препарат используют в количестве до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода не менее (35-45)%.

Использование в качестве исходного сырья рисовой муки в количестве 205,3-235,7 г или ржаной муки 232,0-290,6 г, а также предварительное выдерживание рисовой или ржаной муки в воде при температуре 20-25°С в течение 10-12 часов способствует максимальному выходу из растительных клеток растворимых углеводов и белка, необходимых для роста и развития гриба Aspergillus niger, что обеспечивает соотношение углерода и азота (20-23):1 для суспензии рисовой муки и (14-16):1 – для суспензии ржаной муки, сокращает длительность гидролиза и повышает выход -амилазы и глюкоамилазы.

Использование ферментного препарата в количестве до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода 35-45% также повышает выход -амилазы и глюкоамилазы, при этом сохраняя и высокий выход лимонной кислоты.

В качестве исходного крахмалосодержащего сырья используют суспензию рисовой или ржаной муки с концентрацией сухих веществ 25 мас.%, приготовленную из сухой рисовой или ржаной муки с содержанием сухих веществ 86 мас.%, а в качестве ферментного препарата бактериальной -амилазы используют препарат, выпускаемый отечественной промышленностью под торговым названием «Амилосубтилин ГЗХ» или «Амилосубтилин Г10Х» с активностью от 1000 до 3000 единиц амилолитической способности (А.С) на 1 г препарата, в примерах используют препарат 1000 ед. А.С/г, а в качестве продуцента целевых продуктов выбраны штаммы гриба Aspergillus niger ВКПМ F-171, ВКПМ F-501 и ВКПМ F-719, известные продуценты лимонной кислоты для биоконверсии свекловичной мелассы /2, 3/ и сока сорго /4/.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

а) Подготовка конидий продуцента

Конидии гриба-продуцента Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171 взвешивают в стерильную пробирку в расчете 250 мг на 100 см³, помещают в среду следующего состава, г/дм³: сахар-песок – 50,0, дигидроортофосфат калия – 0,16, нитрат аммония – 2,50, сульфат магния гептагидрат – 0,25.

Суспензию конидий гриба в колбе ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают 5-6 часов при температуре 32°С.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия

50,0 г сахара-песка, 0,16 г дигидроортофосфата калия, 2,50 г нитрата аммония, 0,25 г сульфата магния гептагидрата растворяют в 1 дм³ водопроводной воды. Затем раствор выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 25-32°С.

в) Приготовление питательной среды для ферментации

205,3 г рисовой муки заливают водопроводной водой при температуре 20°С, доводят объем до 500 см³ и выдерживают при температуре 20°С в течение 10 часов, затем нагревают до 40°С, получая 41,0 мас.%-ную суспензию рисовой муки (в расчете на сухое вещество) с содержанием углерода и азота в соотношении 23:1, которую нагревают при интенсивном перемешивании до 55-60°С и вводят ферментный препарат бактериальной -амилазы в количестве, обеспечивающем ДЕ, равный 35%. При постоянном перемешивании доводят температуру до 82-85°С и выдерживают при этой температуре 60 мин. Для прекращения действия ферментного препарата полученный гидролизат нагревают до кипения, охлаждают до 20-22°С, доводят объем до 500 см³.

Затем гидролизат рисовой муки с ДЕ, равным 35%, выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 45-50°С и стерильно вносят 0,5 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, 1,25 см³ раствора сульфата магния гептагидрата концентрации 10 мас.%, 0,80 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас.%, 0,5 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 мас.% и стерильно разбавляют водой до 1,00 дм³. Концентрация ферментируемых сахаров 130,6 г/дм³ среды.

г) Выращивание посевного мицелия

В колбу емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают 10 см³ суспензии конидий. Колбу ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 36 часов при температуре 32°С.

д) Ферментация питательной среды на основе гидролизата рисовой муки

В колбу емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают ее 9 см³ подрощенного мицелия. Колбу ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 5 сут при температуре 32°С. После ферментации биомассу гриба отделяют на воронке Бюхнера и в культуральном растворе определяют конверсию сахаров в лимонную кислоту и активность кислотоустойчивых амилолитических ферментов: -амилазы – амилолитическую способность, глюкоамилазы – глюкоамилазную способность (Гл.С).

Пример 2

а) Подготовку конидий продуцента – гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но суспензию рисовой муки выдерживают в водопроводной воде в течение 12 часов при температуре 25°С, в результате гидролиза получают ДЕ, равный 40%.

Пример 3

а) Подготовку конидий продуцента – гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-719, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, время выдерживания в воде 11 часов, а для приготовления гидролизата используют 235,7 г рисовой муки, получая 47,1 мас.%-ную суспензию рисовой муки (в расчете на сухое вещество) с содержанием углерода и азота в соотношении 20,0:1, и используют гидролизат рисовой муки с ДЕ, равным 45%. Концентрация ферментируемых сахаров 150,0 г/дм³ среды.

Пример 4

Подготовку конидий продуцента – гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1, но готовят суспензию из 232,0 г ржаной муки, получая 46,4 мас.%-ную суспензию ржаной муки (в расчете на сухое вещество) с содержанием углерода и азота в соотношении 14:1, и используют гидролизат с ДЕ, равным 40%. Концентрация ферментируемых сахаров 119,7 г/дм³ среды.

Пример 5

Используют продуцент – гриб Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501, подготовку его конидий и ферментацию проводят аналогично примеру 1, но готовят суспензию из 271,3 г ржаной муки, выдерживают при температуре 25°С в течение 11 часов, получая 54,2 мас.%-ную суспензию ржаной муки (в расчете на сухое вещество), получают суспензию ржаной муки с содержанием углерода и азота в соотношении 15,4:1,0 и используют гидролизат с ДЕ, равным 37%. Концентрация ферментируемых сахаров 140,9 г/дм³ среды.

Пример 6

Используют продуцент – гриб Aspergillus niger штамм ВКПМ F-719, подготовку его конидий и ферментацию проводят аналогично примеру 1, но готовят 58,1 мас.%-ную суспензию из 290,6 г ржаной муки, которую выдерживают в водопроводной воде в течение 12 часов при температуре 22°С, получая суспензию с содержанием углерода и азота в соотношении 16:1, и используют гидролизат с ДЕ, равным 43%. Концентрация ферментируемых сахаров 149,9 г/дм³ среды.

Пример 7 (по прототипу).

Подготовку конидий продуцента – гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501, выращивание посевного мицелия, приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но используют для приготовления питательной среды суспензию из 140,0 г крахмала и 20 г кукурузной муки в нагретой до 40°С водопроводной воде с доведением объема до 500 см³ и нагреванием до 40-50°С, получая 32,0 мас.%-ную суспензию, введением препарата бактериальной -амилазы в количестве, обеспечивающем ДЕ, равный 26%, внесением 25,5 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, обеспечивающем в среде соотношение углерода и азота 50:1. Концентрация ферментируемых сахаров 135,4 г/дм среды.

Технический результат в опытах, представленных в примерах 1-6 таблицы, по сравнению с прототипом заключается в увеличении конверсии сахаров в лимонную кислоту до (86,7-93,2)% и увеличении активности ферментов: -амилазы и глюкоамилазы соответственно до 4,5-6,2 единиц А.С/см³ и 160-180 единиц Гл.С/см³.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Патент РФ 2215036, публ. 2003 г.

2. Патент РФ 2266960, публ. 2005 г.

1. Патент РФ 975799, публ. 1982.

2. Патент СССР 1811697, публ. 1993.

3. Патент РФ 2088658, публ. 1997.

Формула изобретения

Способ получения лимонной кислоты, -амилазы и глюкоамилазы, включающий гидролиз крахмалсодержащего сырья ферментным препаратом бактериальной -амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger, отличающийся тем, что в качестве крахмалсодержащего сырья используют рисовую в количестве 205,3-235,7 г или ржаную муку в количестве 232,0-290,6 г, предварительно выдержанную в воде при температуре 20-25°С в течение 10-12 ч, обеспечивающем содержание в полученной суспензии рисовой муки углерода и азота в соотношении (20,0-23,0):1, а в суспензии ржаной муки (14,0-16,0):1 соответственно, ферментный препарат используют в количестве до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода 35-40%.