Патент на изобретение №2366707
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК С АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ КЛЕТОК, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА В
(57) Реферат:
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Выделяют из периферической крови пациентов больных хроническим вирусным гепатитом В дендритные клетки, презентирующие антиген вируса гепатита В. Культивируют с неприлипающей фракцией мононуклеарных клеток в присутствии провоспалительного цитокина рчИЛ-18. Изобретение позволяет генерировать клетки, обладающие высоким цитотоксическим потенциалом в отношении клеток, инфицированных антигенами гепатита В. 3 табл.
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита В. В основе патогенеза хронического вирусного гепатита В лежит нарушение взаимодействия иммунокомпетентных клеток. Персистенция вируса гепатита В развивается в результате подавления индукции и реализации иммунного ответа. Механизмами ускользания вируса из-под иммунного ответа являются: интеграция генома вируса в геном иммунокомпетентных клеток; изменение протективных эпитопов каждые 5-6 лет; истощение антивирусных Т-клонов; аутоагрессия против Т-клеток, экспрессирующих вирусные пептиды; блокирование представления собственных антигенов за счет снижения синтеза ФНО- Описан способ (прототип), при котором незрелые ДК получали из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В путем культивирования в полной среде с добавлением гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) в течение 7 дней, незрелые ДК в течение 2 суток культивировались с ФНО- Направленность развития протективного иммунного ответа зависит от многих факторов, в том числе во многом от баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Интерлейкин-18 (ИЛ-18) – провоспалительный цитокин, который стимулирует продукцию ИФН- Таким образом, для эффективной модуляции противовирусной защиты необходимо повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток, продуцирующих ИФН- Задачей настоящего изобретения является создание способа генерации максимально эффективных антиген-специфических цитотоксических клеток из периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В. Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем. Мононуклеарные клетки неприлипающей фракции периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В культивируют с обработанными антигеном вируса гепатита В дендритными клетками в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18. Техническим результатом изобретения является активация антиген-специфических иммунных реакций по Т-хелпер 1 типу на антиген вируса гепатита В с помощью цитотоксических ИФН- Предложенный способ позволяет генерировать клетки, обладающие высоким цитотоксическим потенциалом в отношении клеток, инфицированных антигенами гепатита В, за счет синергизма воздействия на модуляцию специфического иммунного ответа аутологичных активированных дендритных клеток и провоспалительного цитокина интерлейкина-18. Изобретение осуществляется следующим образом. Выделенные из периферической крови пациентов больных хроническим вирусным гепатитом В мононуклеарные клетки прилипающей фракции культивируются в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СО2 при 37°С с добавлением ГМ-КСФ (50 нг/мл) и ИЛ-4 (200 нг/мл). Через 24 часа культивирования к полученным незрелым ДК добавляется специфический антиген вируса гепатита В HBcAg в дозе 5 мкг/мл, а еще через 2 часа для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов вносится рчФНО- Полученные дендритные клетки культивируются с мононуклеарными клетками неприлипшей фракции в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-18 в дозе 40 нг/мл. Для определения эффективности модуляции противовирусного иммунного ответа с помощью полученных ДК оценивали пролиферативную активность МНК, предварительно культивированных с антиген-активированными ДК, в ответ на специфический антиген вируса гепатита В HBcAg (табл.1).
Кроме того, для тестирования активации Т-хелперов 1 типа оценивали уровень продукции ИФН-
Для исследования потенциальной цитотоксической активности определяли экспрессию молекул перфорина мононуклеарными клетками, предварительно культивированными с антиген-активированными ДК в ответ на специфический антиген HBcAg. Перфорин – фактор цитотоксичности, мономерный белок, вызывающий образование пор в цитоплазматической мембране, что приводит к лизису инфицированных клеток. Показано достоверное повышение количества перфорин-позитивных клеток, что служит показателем активации цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения инфицированных клеток (табл.3).
Совместное культивирование ДК и МНК больных хроническим вирусным гепатитом В является эффективным способом генерации специфических цитотоксических клеток мононуклеарного происхождения, что проявляется в усилении их пролиферативного потенциала, стимуляции уровня продукции ИФН-
Формула изобретения
Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток, инфицированных вирусом гепатита В, заключающийся в совместном культивировании мононуклеарных клеток периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом В с обработанными антигеном вируса гепатита В аутологичными дендритными клетками, отличающийся тем, что культивирование дендритных клеток проводят с неприлипающей фракцией мононуклеарных клеток в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-18.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
; репликация вируса в органах, не подлежащих иммунному надзору; персистенция вируса в иммунокомпетентных клетках и разобщение всех клеток иммунной системы. Стандартное лечение хронического вирусного гепатита В основано на применении интерферонов и противовирусных средств, подавляющих репликацию вируса. Лекарственная химиотерапия часто приводит к развитию лекарственно-устойчивых штаммов возбудителей инфекции и поэтому становится неэффективной, кроме того, обладает выраженным гепатотоксическим действием. В настоящее время развитие новых эффективных подходов к лечению инфекционных заболеваний связано с использованием собственных механизмов защиты организма и их возможной модуляции. Эффективный иммунный ответ на вирус гепатита В связан с индукцией клеточного звена иммунного ответа, который в данном случае реализуется посредством Т хелперов 1 типа. Активность Т хелперов 1 типа напрямую зависит от представления им антигена и их направленной дифференцировки, что осуществляется дендритными клетками как основными антиген-презентирующими клеточными элементами. Дендритные клетки (ДК) усиливают врожденный иммунитет, регулируют развитие специфического иммунного ответа, обеспечивают развитие иммунологической толерантности. В настоящее время активно исследуется возможность применения дендритных клеток для модуляции специфического иммунного ответа и развития новых методов иммунокоррекции. Это связано, прежде всего, с той ролью, которую ДК играют в организме в развитии иммунного ответа, в частности, дендритные клетки обладают уникальными механизмами захвата антигена и представления его наивным Т-клеткам, определяя направленность и активность иммунных реакций.
-продуцирующих CD8+ клеток в ответ на антигенный пептид HbcAg18-27. При этом МНК ПК, сокультивированные с ДК, обработанными специфическим белком, индуцируют специфическую Т клеточную реакцию, в которой уровень секреции цитокинов и литической аткивности выше, чем в реакции, индуцированной клетками памяти [Li RB, Chen HS, Xie Y, Fei R, Cong X, Jiang D, Wang SX, Wei L, Wang Y. Dendritic cells from chronic hepatitis В patients can induce HBV antigen-specific T cell responses. World J Gastroenterol 2004; 10(11): 1578-1582].