Патент на изобретение №2366705
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ СОЗДАНИЯ ВОССТАНОВИТЕЛЕЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ ЯРОВОГО РАПСА (BRASSICA NAPUS L.)
(57) Реферат:
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения восстановителей фертильности. Изобретение представляет собой способ создания восстановителей фертильности ярового рапса in vitro. Отбирают донорский материал и проводят предобработку центральных кистей растений ярового рапса со стерильной цитоплазмой и генами восстановления фертильности температурой +4-6°С в течение суток. Вводят в культуру неоплодотворенные семязачатки с бутонов длиной 2-4 мм и культивируют их на питательной среде MS с добавлением 1 мг/л кинетина, 0,2 мг/л НУК и 0,1 мг/л 2,4-Д, осуществляют стабилизацию и микроразмножение гаплоидных линий, диплоидизацию путем добавления 0,005% раствора колхицина в питательную среду. Укорененные растения пересаживают в грунт, где они формируют семена, которые высевают в поле для получения растений-восстановителей фертильности. Изобретение позволяет получить новый исходный материал для гетерозисной селекции на основе ЦМС. 2 ил., 2 табл.
Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности, к селекции и может быть использовано в сельскохозяйственной биотехнологии при культивировании неоплодотворенных семязачатков для получения нового исходного гомозиготного материала для гетерозисной селекции. th Intern. Rapeseed Congress, Cambridge, UK, 4-7.07.1995 – Vol.1. – P.104-106). Недостатком метода является длительность процесса создания гомозиготных линий (5-7 лет).
Недостатком данного метода является невозможность получения исходного материала ярового рапса для гетерозисной селекции на основе цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС), т.к. эксплантом являются пыльники, а у растений с ЦМС пыльца стерильна. В связи с этим сохранение материнской цитоплазмы возможно только с помощью культивирования неоплодотворенных семяпочек in vitro. В ходе проведения патентного поиска авторами не обнаружено аналогичных исследований для ярового рапса. Задачей изобретения является создание исходного материала для гетерозисной селекции на основе ЦМС. В гетерозисной селекции основным требованием, предъявляемым к родительским компонентам, является их гомозиготность по большинству генов. Одним из путей получения гомозиготных линий ярового рапса является гаплоидия – явление возникновения особей с гаметическим числом хромосом. С помощью методов биотехнологии гаплоиды получают из репродуктивных клеток при культивировании изолированных пыльников или неоплодотворенных семяпочек на искусственных питательных средах. При этом процесс формирования гомозиготных линий ускоряется по сравнению с традиционными методами селекции в 5-7 раз. Предлагается способ создания восстановителей фертильности ярового рапса с помощью культивирования неоплодотворенных семяпочек in vitro. Развитие семяпочек идет по пути образования каллуса с формированием на нем ростовых почек с последующим их развитием в растения. Указанный способ включает в себя следующие операции: 1. Донорским материалом являются гибриды между стерильным образцом и восстановителями фертильности. Бутоны предпочтительно брать с центральной кисти, так как по сравнению с побегами первого и второго порядков они обладают максимальной способностью к каллусообразованию (5,7%) и регенерации (1,3%). Для изолирования семязачатков используются бутоны длиной 2-4 мм с центральной кисти основного побега ярового рапса, частота образования каллуса у которых составляет 3,3%, а выход регенерантов достигает 0,7% (фиг.1). 2. Предобработку соцветий донорского материала для увеличения индуцирующей способности неоплодотворенных семязачатков перед стерилизацией следует проводить пониженной температурой +4-6°С в течение суток (фиг.2). 3. Для стерилизации бутонов ярового рапса наряду с 7%-м раствором Domestos используются экологически чистые электроактивированные водные растворы анолит и смесь анолита с католитом (рН=7), ускоряющие развитие неоплодотворенных семяпочек ярового рапса в культуре in vitro (табл.1).
4. Культивирование неоплодотворенных семязачатков осуществляется на питательной среде MS, содержащей 1 мг/л кинетина, 0,2 мг/л НУК и 0,1 мг/л 2,4-Д при 16-часовом фотопериоде и освещенности 5 тыс. люкс. Образовавшиеся на каллусе ростовые почки переносятся на безгормональную среду, на которой происходит регенерация гаплоидных проростков. 5. Стабилизация гаплоидов осуществляется одновременно с микроразмножением и проводится в течение 3-4 пассажей с чередованием ростовой (ГК, кинетин, 6-БАП по 0,2 мг/л) – безгормональной – ростовой сред для нормально развитых регенерантов, и безгормональной – ростовой – безгормональной для слабо развитых регенерантов. 6. Диплоидизация гаплоидного материала осуществляется путем добавления в питательную среду 0,005% колхицина и выдержке на ней эксплантов в течение 48 часов. Стабилизация колхицинированных растений ведется при последующем культивировании на питательной среде, содержащей 0,25 мг/л кинетина, в течение месяца. 8. Формирование корней осуществляется при культивировании микроклонов на среде с 1 мг/л НУК. Затем следует пересадить растения в грунт, где они формируют семена. 9. Семена полученных линий высеваются в поле и собранной с них пыльцой проводится опыление форм с ЦМС для анализа способности восстанавливать фертильность. В результате применения метода культуры неоплодотворенных семязачатков получены линии, донорские растения которых имели стерильную цитоплазму типа Polima и гены восстановления фертильности. В условиях теплицы и поля полученные растения цвели и после опыления их пыльцой формы, обладающей ЦМС, завязались семена. 10. Семена полученных растений высеваются в поле и проводится анализ фертильности пыльцевых зерен. Полученные семена были высеяны в теплице, и у растений в период цветения проведен анализ фертильности, позволивший выявить 87,3-94,5% фертильных пыльцевых зерен (табл.2). Установлено, что фертильность донорского растения
Разработанный способ получения восстановителей фертильности в течение 1-1,5 лет может обеспечить получение необходимого объема растений ярового рапса для включения в селекционный процесс. Данный подход к получению восстановителей фертильности возможен и для других видов культурных растений, у которых семеноводство гетерозисных гибридов осуществляется на основе ЦМС.
Формула изобретения
Способ создания восстановителей фертильности ярового рапса in vitro, включающий введение эксплантов в культуру, получение гаплоидных растений, их диплоидизацию, корнеобразование и пересадку в грунт, отличающийся тем, что проводят предобработку центральных кистей растений со стерильной цитоплазмой и генами восстановления фертильности температурой 4-6°С в течение суток, вводят в культуру неоплодотворенные семязачатки с бутонов длиной 2-4 мм, культивируют на питательной среде MS с добавлением 1 мг/л кинетина, 0,2 мг/л НУК и 0,1 мг/л 2,4-Д, осуществляют стабилизацию и микроразмножение гаплоидных линий, диплоидизацию путем добавления 0,005% раствора колхицина в питательную среду; укорененные растения пересаживают в грунт, где они формируют семена, которые высевают в поле для получения растений-восстановителей фертильности.
РИСУНКИ
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
