Патент на изобретение №2366700

(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ПРИ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА

(57) Реферат:

Питательная среда для выращивания первичных культур микобактерий включает солевую основу в составе: магний сернокислый – 0,5 г, натрий лимоннокислый – 1,0 г, квасцы железоаммиачные – 0,05 г, калий фосфорнокислый однозамещенный – 20,0 г, алюминий лимоннокислый однозамещенный – 5,0 г, натрий глутаминовокислый однозамещенный – 10,0, глицерин – 20 мл, вода дистиллированная – до 1000 мл, яичную массу, 2%-ный раствор малахитовой зелени и пантолизат пантового шрота, при следующем соотношении компонентов, мл: солевая основа 1000, яичная масса 700-1000, пантолизат 300-1000, 2%-ный раствор малахитовой зелени 33. Пантолизат пантового шрота готовят путем водной экстракции пантового шрота при соотношении шрот: вода 1:4-1:5, температуре процесса 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 ч. Это обеспечивает улучшение ростовых качеств среды и повышение ее информативности. 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к производству питательных сред, и может быть использовано в медицине и ветеринарии при диагностике туберкулеза.

Известны яичные среды для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза, среды: Петраньяни, Гельберта, Левенштейна-Йенсена. Расход яиц на приготовление вышеприведенных сред составляет 10-16 штук на 1 л среды («Наставление по диагностике туберкулеза животных», МСХ РФ Департамент ветеринарии, М., 2002, с.44-48).

Известна яичная среда Финн-2 для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза, которая в бактериологической диагностике (согласно многим исследованиям) характеризовалась более высокой эффективностью. Питательная среда Финн-2 содержит солевую основу, включающую:

– магний сернокислый – 0,5 г;

– натрий лимоннокислый – 1,0 г;

– квасцы железоаммиачные – 0,05 г;

– калий фосфорнокислый однозамещенный – 20,0 г;

– алюминий лимоннокислый однозамещенный – 5,0 г;

– натрий глутоминовокислый однозамещенный – 10,0;

– глицерин – 20 мл;

– вода дистиллированная – до 1000 мл.

Ингредиенты растворяют в указанной последовательности в теплой дистиллированной воде при pH 6,3-6,5. Раствор стерилизуют при 1 атм в течение 20 минут. Цельные яйца в количестве 40 штук (2000 мл) гомогенизируют до образования однородной массы, в которую добавляют 33 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и 1 литр солевого раствора. Смесь фильтруют, разливают по пробиркам и свертывают при температуре 85°С в течение 30 минут (см. там же среда Финн-2 – прототип).

Однако использование яичных сред для выращивания первичных культур микобактерий туберкулеза характеризуется большим расходом яиц, являющихся одним из основных продуктов питания человека. Кроме этого в связи с эволюционной изменчивостью возбудителя, бесконтрольным применением лекарственных средств и биопрепаратов снизилась информативность бактериологических исследований при туберкулезе.

Необходима разработка питательной среды, позволяющей сократить расход яиц при производстве питательных сред и повысить их информативность.

Указанный технический результат достигается тем, что питательная среда, включающая солевую основу, яйца, водный 2%-ный раствор малахитовой зелени, дополнительно содержит пантолизат на основе пантового шрота, являющегося побочным продуктом при производстве пантокрина. Питательная среда представлена следующим соотношением компонентов, мл:

– солевая основа – 1000;

– яйца (20-34 мг) – 1700-1000;

– пантолизат – 300-1000;

– 2%-ный раствор малахитовой зелени – 33

Пантолизат готовят экстракцией смеси шрота и воды в соотношении шрот:вода 1:4-1:5, температуре процесса 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 часов.

Химический анализ пантового шрота показывает, что в пантокрин при его производстве переходит всего 3% сухого вещества пантовой муки (размолотого панта). 90% суммарного содержания аминокислот и 30% липидов остаются в пантовом шроте. Таким образом, после водной экстракции пантового шрота в пантолизате находится достаточное количество аминокислот, микро- и макроэлементов и липидов. Качественный состав липидов представлен в пантолизате фосфолипидами, стеринами, жирными кислотами, триглицеридами, эфирами стеридов. Микобактерии весьма устойчивы к воздействию факторов внешней среды и химическим веществам, именно из-за наличия в микробной клетке жировосковых веществ. В отличие от других микроорганизмов микобактерии туберкулеза характеризуются высоким содержанием липидов, достигающим 10-40% сухого вещества микобактерий. Фосфолипиды составляют около 20% от всех липидов микобактерий. В растущих клетках микобактерий происходит как синтез, так и расщепление фосфолипидов, являющихся существенными структурными элементами клеточных стенок микобактерий. Глицериды и воски служат запасными внутриклеточными веществами: когда клетка использует весь субстрат среды, она начинает потреблять внутренние резервы. Таким образом, увеличение липидной составляющей в модифицированной среде Финн-2, при более высоком и более разнообразном аминокислотном ее составе, является новой питательной средой, которая должна обеспечить наиболее высокую интенсивность и качественные показатели роста микобактерий.

Для разработки модифицированной среды на основе питательной среды Финн-2 15%, 25 и 50% яичной массы заменяли на равное количество пантолизата, с условием, что объем 1-го яйца – 50 мл, при прежнем количестве солевой основы и 2%-ного раствора малахитовой зелени.

Результаты исследований отражены в таблице 1.

Таблица 1
Вид микроорганизма и показатели роста	Питательные среды в опытах
Финн-2 (контроль)	Финн-2 с пантолизатом (15%)	Финн-2 с пантолизатом (25%)	Финн-2 с пантолизатом (50%)
прототип	1 опыт	2 опыт	3 опыт
M.flavescens (атипичные)
Первичный рост, суток	3	3	3	3
Первичный рост, %	100	100	100	100
Характер роста	сплошной рост	сплошной рост	сплошной рост	сплошной рост
М. bovis
Первичный рост, суток	6	6	6	6
Интенсивный рост, суток	21	16	17	19
Первичный рост, %	61	80	80	60
Характер роста	75 точечных колоний	150 точечных колоний	147 точечных колоний	100 точечных колоний
Биоматериал от морской свинки (органы с характерными изменениями)
Первичный рост, суток	16	16	16	16
Интенсивный рост, суток	26	20	20	21
Первичный рост, %	50	100	100	70
Характер роста	87 точечных колоний	140 точечных колоний	136 точечных колоний	95 точечных колоний

Как видно из таблицы 1, замена 15, 25 и 50% яичной массы на пантолизат существенно повлияла на улучшение ростовых качеств при выращивании М. bovis и микобактерий из биоматериала от морской свинки. При выращивании М. flavescens (являющейся одной из многочисленных в количественном отношении микобактерий, изолированных из биоматериала маралов (18,8%) и обуславливающих сенсибилизацию животных к туберкулезу) ростовые качества среды не уступают данным показателям среды Финн-2 (контроль).

Сроки появления первичных колоний М. bovis были одинаковы на всех испытуемых средах (6 суток), однако на среде Финна-2 первичный рост на 6 сутки был отмечен лишь в 6 пробирках из 10 (60%), как и на модифицированной среде при 50%-ной замене яичной массы на пантолизат (3 опытная среда), в то время как на 1 и 2 опытных средах (при 15 и 25%-ной замене) первичный рост на 6 сутки наблюдался в 8 пробирках из 10 (80%). В дальнейшем во всех 40 пробирках происходил интенсивный рост колоний, однако сроки накопления бактериальной массы в 1 и 2 опытных группах были значительно меньше. На 21 сутки на среде по прототипу было отмечено 75 точечных колоний (в среднем на одну пробирку), на 1, 2, 3 опытных средах уже на 16, 17 и 19 день этот показатель составил 150, 147 и 100 колоний соответственно.

Высокая результативность опытных сред наблюдалась и при изоляции М. bovis из биоматериала от морской свинки (органы с характерными изменениями). Интенсивный рост культур был обнаружен на 5 (21-16) суток раньше на 3 опытной среде при наличии 95 точечных колоний и на 6 суток раньше на 1 и 2 опытных средах при наличии 140 и 136 точечных колоний, в отличие от прототипа (среда Финн-2), где на 26 сутки насчитывалось всего 87 колоний.

Как видно из таблицы 1, испытания опытных сред были проведены на средах от 15 до 50%-ной замене яичной массы на пантолизат и, поскольку с увеличением процента замены от 25 до 50 несколько снижалась результативность показателей роста по сравнению с 25%-ной заменой, исследования с еще более высоким процентом замены следовало считать нецелесообразным, тем более что показатели роста на 3 опытной среде (50% замены) были хотя и несколько выше, но очень близки показателям по прототипу (среда Финн-2). Таким образом, опытные среды с 15-50%-ной заменой яичной массы на пантализат заметно стимулирует рост микобактерий, повышая информативность питательной среды.

Пример 1. Модифицированную питательную среду готовят следующим образом:

1) 1 литр солевой основы (включающей 0,5 г магния сернокислого (MgSО₄·7H₂О), 1,0 г натрия лимоннокислого, 0,05 г квасцов железоаммиачных, 20 г калия фосфорнокислого однозамещенного (K₂НРО₄), 5,0 г аммония лимоннокислого однозамещенного, 20 мл глицерина (С₃Н₈О₃), и растворенных в указанной последовательности в теплой дистиллированной воде) стерилизуют при 1 атм в течение 20 минут.

2) 20 цельных яиц моют в теплой воде с мылом, обрабатывают спиртом, разбивают в стерильную колбу и взбалтывают до образования однородной массы.

3) 2 г малахитового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 30 минут.

4) К 1000 мл яичной массы (20 яиц, т.е 50%-ная замена яиц пантолизатом), смешанной с 1000 мл пантолизата добавляют 33 мл 2%-ного раствора малахитовой зелени и 1000 мл солевого раствора. Смесь фильтруют через марлевый фильтр, разливают в пробирки по 4-5 мл и свертывают при температуре 85°С в течение 30 минут.

Пример 2. Технология приготовления ингредиентов и модифицированной питательной среды по примеру 1. Соотношение ингредиентов:

– солевая основа – 1000 мл;

– яичная масса (30 яиц, т.е 25%-ная замена яичной массы на пантолизат) – 1500 мл;

– пантолизат – 500 мл;

– 2%-ный раствор малахитовой зелени – 33 мл.

Пример 3. Технология приготовления ингредиентов и модифицированной питательной среды по примеру 1. Соотношение ингредиентов:

– солевая основа – 1000 мл;

– яичная масса (24 яйца, т.е. при 40% замены яичной массы на пантолизат) – 1200 мл;

– пантолизат – 800 мл;

– 2%-ный раствор малахитовой зелени – 33 мл.

Пример 4. Технология приготовления ингредиентов и модифицированной питательной среды по примеру 1. Соотношение ингредиентов:

– солевая основа – 1000 мл;

– яичная масса (34 яйца, при 15%-ной замене яичной массы на пантолизат) – 1700 мл;

– пантолизат – 300;

– 2%-ный раствор малахитовой зелени – 33.

Таким образом, использование заявленной питательной среды для выращивания первичных культур микобактерий при бактериологической диагностике туберкулеза позволяет сократить расход яиц при производстве питательных сред и повысить их информативность.

Формула изобретения

Питательная среда для выращивания микобактерии при бактериологической диагностике туберкулеза, включающая солевую основу в составе: магний серно-кислый – 0,5 г, натрий лимонно-кислый – 1,0 г, квасцы железоаммиачные – 0,05 г, калий фосфорно-кислый однозамещенный – 20,0 г, алюминий лимонно-кислый однозамещенный – 5,0 г, натрий глутаминово-кислый однозамещенный – 10,0, глицерин – 20 мл, вода дистиллированная – до 1000 мл, яичную массу, 2%-ный раствор малахитовой зелени, отличающаяся тем, что питательная среда дополнительно содержит пантолизат пантового шрота, приготовленный путем водной экстракции пантового шрота при соотношении шрот: вода 1:4-1:5, температуре процесса 98-99°С под давлением 1,5 атм в течение 3-4 ч, при следующем соотношении компонентов, мл: