Патент на изобретение №2366452

(54) СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ МИЕЛОПОЭЗА

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для стимуляции миелопоэза. Способ осуществляется следующим образом. Лабораторным животным одновременно вводят внутрибрюшинно препарат гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сут, в течение 2 дней, и подкожно препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сут, в течение 5 дней. Сочетанное применение компонентов способа позволяет эффективно стимулировать миелопоэз за счет суммации гематотропного действия гиалуронидазы и Г-КСФ. 2 табл.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к гематологии и фармакологии, и касается способа стимуляции миелопоэза.

На сегодняшний день во всем мире отмечается увеличение частоты встречаемости заболеваний системы крови. Кроме того, сохраняется высокая частота развития осложнений, связанных с нарушением кроветворения при проведении химио- и лучевой терапии у пациентов с онкопатологией. Указанные факты являются основанием для поиска новых эффективных медикаментозных патогенетически обоснованных способов стимуляции гемопоэза, которые с успехом могли бы применяться в гематологической практике.

Известен способ стимуляции миелопоэза (эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения одновременно) с помощью гиалуронидазы [1]. Данный способ является наиболее близким к заявляемому по механизму действия и техническому результату и выбран в качестве прототипа.

Недостатком способа стимуляции миелопоэза с помощью гиалуронидазы является его относительно низкая эффективность.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ стимуляции миелопоэза, заключающийся в одновременном введении лабораторным животным (мыши) внутрибрюшинно препарата гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сут, в течение 2 дней, и подкожно препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сут, в течение 5 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является дополнительное введение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сут в течение 5 дней.

Гналуроновая кислота (ГК) является одним из основных компонентов межклеточного матрикса тканей организма, в том числе и гемопоэтической ткани (около 40% от всех гликозаминогликанов [2]). Согласно современным представлениям молекулы ГК с различной длиной полисахаридной цепи оказывают разное влияние на многие биологические процессы и функциональную активность клеточных элементов [3, 4]. Известно, что низко- и среднемолекулярные формы ГК стимулируют ангиогенез, пролиферацию, дифференцировку и миграцию клеток. В то время как молекулы ГК с высокой молекулярной массой, напротив, тормозят сосудообразование, ингибируют деление клеток и снижают их способность к миграции [3, 4]. При этом важная роль в метаболизме и поддержании баланса различных форм ГК in situ принадлежит гиалуронидазе – ферменту, под действием которого происходит гидролитическое расщепление полимеров [3]. Вместе с тем установлено, что состояние межклеточного матрикса кроветворной ткани способно влиять на гемопоэз [1]. Известно, что гиалуронидаза способна стимулировать эритроидный и грануломоноцитарный росток кроветворения (активировать миелопоэз). Однако ее влияние менее эффективно в отношении гранулоцитарного ростка кроветворения, чем при введении гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), и в меньшей степени эффективно в отношении эритропоэза, чем рекормон (препарат рекомбинантного эритропоэтина, наиболее часто используемый для лечения анемий). При этом известно, что Г-КСФ является эндогенным регулятором гранулоцитопоэза, который не оказывает стимулирующего влияния на эритроидный росток кроветворения, либо даже, напротив, в отдельных случаях вызывает снижение интенсивности процессов эритропоэза (в силу реципрокных отношений между указанными ростками кроветворения) [5, 6]. Кроме того, опытным путем нами показано, что заявляемые доза и режим введения Г-КСФ (по 125 мкг/кг в течение 5 дней) являются максимально эффективными для стимуляции грануломоноцитопоэза. При этом его комбинация с другими гемостимуляторами (с разными и отличными механизмами действия от такового у гиалуронидазы), оказывающими влияние на грануломонопоэз (нуклеинат натрия, зимозан, метилурацил, кропанол [7]), не сопровождается значимым повышением степени активации грануломоноцитопоэза. Т.е. при совместном применении Г-КСФ (в оптимальной дозе) с другими средствами, активными в отношении гранулоцитарного ростка кроветворения, не происходит «суммации эффектов», что, очевидно, связано с максимальной активацией клеточных элементов «буферного отдела» кроветворной ткани – коммитированных клеток-предшественников, обеспечивающих регенерацию гемопоэтической ткани, под влиянием Г-КСФ [8]. В связи с этим усиление специфического гранулоцитопоэзстимулирующего эффекта Г-КСФ с помощью дополнительного введения каких бы то ни было препаратов (в том числе и гиалуронидазы), не представляется очевидным.

На сегодняшний день не изучена возможность модификации (усиления) как гранулоцитопоэзстимулирующего эффекта Г-КСФ с помощью гиалуронидазы, так и способность Г-КСФ повышать стимулирующие свойства гиалуронидазы в отношении эритропоэза.

Факт совместного применения гиалуронидазы и Г-КСФ с достижением нового технического результата: создание эффективного способа стимуляции миелопоэза за счет взаимного усиления специфических гематотропных эффектов каждого из используемых веществ и их синергичного (потенцирующего) действия в отношении эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения, для специалиста является не очевидным. Эксперимент показал непредсказуемый результат.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют значительно повысить эффективность способа. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Лабораторному интактному животному (мыши) либо животному после моделирования у него цитостатической миелосупрессии путем однократного введения максимально переносимой дозы (МПД) циклофосфана начинают одновременно вводить внутрибрюшинно препарат гиалуронидазы в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сут, в течение 2-х дней и подкожно препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сут, в течение 5 дней.

Заявляемая доза и режим введения гиалуронидазы и Г-КСФ подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата. Повышение дозы и кратности введения гиалуронидазы отменяют получение заявленного технического результата. Уменьшение дозы гиалуронидазы и/или однократное введение препарата значительно снижают эффективность способа. Повышение дозы и кратности введения Г-КСФ (сопровождаемое увеличением ксенобиотической нагрузки на организм и развитием ряда побочных эффектов и осложнений) не приводит к возрастанию эффективности способа, а снижение указанных показателей режима введения Г-КСФ снижают его эффективность.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 682 шт. массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Для оценки эффективности предлагаемого способа в качестве группы сравнения, кроме мышей, получавших гиалуронидазу (по способу прототипу), использовалась группа животных, которым вводили только Г-КСФ, что позволяло выявить появление абсолютно новых качественных характеристик у Г-КСФ (в частности, в отношении эритропоэза) при его совместном применении с гиалуронидазой.

На 3, 5 и 8-е сут после начала введения препаратов интакным животным и на 4, 6, 8, 10 и 14-е сут при введении препаратов животным на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии (однократное внутрибрюшинное введение циклофосфана в МПД (250 мг/кг) в 0,2 мл) стандартными гематологическими методами определяли количество эритроцитов, ретикулоцитов, содержание различных форм лейкоцитов в периферической крови и показатели костномозгового кроветворения [9]. Кроме того, изучали число зритроидных (КОЕ-Э) и грануломоноцитарных (КОЕ-ГМ) клеток-предшественников в костном мозге [10]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1.

В группе сравнения интактным мышам подкожно 1 раз в сутки в течение 5 дней в дозе 125 мкг/кг вводили Г-КСФ («Нейпоген», «Hoffman-la Roche», Швейцария), растворенный в 0,2 мл растворителя. По способу-прототипу внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2-х дней в дозе 1000 УЕ/кг вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ), растворенную в 0,3 мл физиологического раствора. По заявляемому способу интактным животным одновременно начинали вводить гиалуронидазу и Г-КСФ. Гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ), растворенную в 0,3 мл физиологического раствора, вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2-х дней в дозе 1000 УЕ/кг. Г-КСФ («Нейпоген», «Hoffman-la Roche», Швейцария), растворенный в 0,2 мл растворителя, вводили подкожно 1 раз в сутки в течение 5 дней в дозе 125 мкг/кг.

Контрольным мышам в эквивалентных объемах и режимах вводили физиологический раствор.

Введение интактным животным Г-КСФ приводило к увеличению числа палочко- и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови во все сроки исследования с максимумом до 500,0% от контроля на 5-е сут и до 552,5% на 8-е сут соответственно. Со стороны картины костномозгового кроветворения имела место гиперплазия гранулоцитарного ростка кроветворения: возрастание количества незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов, регистрируемое во все сроки исследования. Указанные изменения явились следствием активации грануломоноцитарных прекурсоров. Наблюдалось значительное повышение КОЕ-ГМ (3,5, 8-е сут) в костном мозге (с максимумом до 575,3% от контроля на 5-е сут соответственно). При этом количество клеточных элементов эритроидного ряда в периферической крови и костном мозге оставалось в пределах фоновых значений (табл.1).

Введение мышам гиалуронидазы приводило к существенному возрастанию количества ретикулоцитов во все сроки исследования с максимальными значениями до 253,6% от контроля на 8-е сут и числа эритроцитов на 8-е сут в периферической крови. При этом, как и в случае с Г-КСФ, имело место достоверное увеличение числа палочко- (3, 5-е сут) и сегментоядерных нейтрофилов (3, 5, 8-е сут), которое, однако, было существенно ниже, чем при использовании Г-КСФ. Указанные изменения явились отражением динамики костномозгового кроветворения. Гиалуронидаза приводила к увеличению содержания эритрокариоцитов в гемопоэтической ткани, достигающее максимальной величины на 5-е и 8-е сут опыта. Число незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге было достоверно выше на 3, 5-е сут, а их зрелых форм – на протяжении всего эксперимента (табл.1). Культуральные исследования механизмов формирования описанных реакций системы крови показали зависимость их развития от состояния пула коммитированных клеток-предшественников. Расщепление ГК приводило к возрастанию числа КОЕ-Э (3, 5, 8-е сут) и КОЕ-ГМ (3, 5, 8-е сут) в костном мозге (с максимумом КОЕ-Э до 276,8% на 3-е и КОЕ-ГМ до 313,3% на 5-е сут соответственно) (табл.1). В целом свойства гиалуронидазы стимулировать грануломоно- и эритроцитопоэз позволяют охарактеризовать ее как эффективный гемостимулятор. Тем не менее, ее активность в отношении гранулоцитарного ростка кроветворения существенно ниже, чем у Г-КСФ.

Совместное применение гиалуронидазы и Г-КСФ приводило к существенно более выраженным изменениям со стороны как эритроидного, так и грануломоноцитарного ростка кроветворения. Гиалуронидаза усиливала специфическое действие Г-КСФ на КОЕ-ГМ, а Г-КСФ, в свою очередь, потенцировал стимулирующее влияние гиалуронидазы на эритроидные прекурсоры. Так, содержание КОЕ-ГМ в костном мозге почти в 2 раза превосходило аналогичные параметры при введении только Г-ГСФ, а количество КОЕ-Э на 3,5-е сут опыта значительно превышало значения соответствующего показателя при назначении только препарата гиалуронидазы (с разницей в 1,8 раза на 3-е сут). Указанные изменения сопровождались и более выраженным, чем при введении одного Г-КСФ, увеличением числа незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов (5, 8-е сут) в костном мозге и палочко- (5, 8-е сут) и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови (8-е сут), а также более значительным, чем при введении только гиалуронидазы, увеличением количества эритрокариоцитов в гемопоэтической ткани во все сроки исследования и ретикулоцитов и эритроцитов в периферической крови (3, 5, 8-е и 8-е сут соответственно) (табл.1).

Таким образом, одновременное введение препаратов гиалуронидазы и Г-КСФ приводило к значительному усилению (потенцированию) эритропоэзстимулирующих свойств гиалуронидазы и выраженному возрастанию способности Г-КСФ к активации грануломоноцитопоэза.

Пример 2.

Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора.

Опытным животным группы сравнения на фоне моделирования миелосупрессии вводили подкожно 1 раз в сутки в течение 5 дней в дозе 125 мкг/кг Г-КСФ («Нейпоген», «Hoffman-la Roche», Швейцария), растворенный в 0,2 мл физиологического раствора. По способу-прототипу внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2-х дней в дозе 1000 УЕ/кг вводили гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ), растворенную в 0,3 мл физиологического раствора. По заявляемому способу гиалуронидазу и Г-КСФ начинали вводить в один день. Гиалуронидазу («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ), растворенную в 0,3 мл физиологического раствора, вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 2-х дней в дозе 1000 УЕ/кг. Г-КСФ («Нейпоген», «Hoffman-la Roche», Швейцария), растворенный в 0,2 мл растворителя, вводили подкожно 1 раз в сутки в течение 5 дней в дозе 125 мкг/кг.

Введение циклофосфана закономерно приводило к выраженной депрессии костномозгового кроветворения. Отмечалось падение содержания эритрокариоцитов (4, 6-е сут), незрелых (4, 6-е сут) и зрелых (4, 6, 8, 10-е сут) нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге. При этом указанная динамика сменялась в дальнейшем нормализацией показателя зрелых нейтрофильных гранулоцитов и увеличением количества эритрокариоцитов и незрелых нейтрофильных гранулоцитов на 10, 14-е сут относительно фоновых значений, свидетельствующее о высокой интенсивности регенераторных процессов в гемопоэтической ткани. Динамика содержания остальных морфологически распознаваемых клеточных элементов в костном мозге в целом носила аналогичный характер. Отражением состояния костномозгового кроветворения явилась картина периферической крови. Имело место резкое снижение содержания ретикулоцитов (4, 6, 8-е сут) и эритроцитов (8-е сут), сменяющееся возрастанием их числа на 10, 14-е сут и на 10-е сут соответственно. Схожая тенденция наблюдалась и со стороны динамики содержания нейтрофилов в периферической крови. В начальные сроки абсолютно не регистрировались их палочкоядерные формы. Данные элементы определялись лишь на 10, 14-е сут, причем их количество было все же ниже исходного уровня. При этом восстановление числа сегментоядерных нейтрофилов начиналось раньше и их количество с 8-х сут превосходило аналогичные параметры у интактных животных. Изучение механизмов регенерации кроветворной ткани показало, что введение циклофосфана сопровождалось падением числа КОЕ-Э и КОЕ-ГМ до 6-х сут исследования. Однако в дальнейшем отмечалось значительное увеличение количества кроветворных прекурсоров (8-е сут) (табл.2).

Введение Г-КСФ животным после моделирования миелосупрессии приводило к более раннему (с 6-х сут) и значимому возрастанию содержания КОЕ-ГМ (до 697,7% цитостатического контроля на 6-е сут опыта), увеличению количества незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге во все сроки наблюдения, а также числа палочко- и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови относительно группы животных, получавших циклофосфан. Таким образом, Г-КСФ значительно ускорял регенерацию грануломоноцитарного ростка кроветворения и абсолютно не оказывал влияния на подавленный цитостатиком эритропоэз (табл.2).

Применение гиалуронидазы на фоне цитостатической миелосупрессии стимулировало процессы регенерации как грануломоноцитарного, так и эритроидного ростков кроветворения. Практически во все сроки опыта отмечалось существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров в гемопоэтической ткани относительно цитостатического контроля (КОЕ-Э с максимумом 634,3%, а КОЕ-ГМ до 438,0% на 6-е сут). Состояние пула родоначальных клеток закономерно приводило к более быстрому и значительному возрастанию содержания эритрокариоцитов (6-14-е сут) (число данных элементов на 6-е сут составляло 201,5% от аналогичного показателя на цитостатическом контроле), незрелых (6, 8, 14-е сут) и зрелых (6, 8-е сут) нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге. Закономерные изменения формировались в периферической крови. Количество исследуемых зрелых элементов крови значительно превосходило число соответствующих показателей в контрольной группе практически во все сроки наблюдения (табл.2). В целом гиалуронидаза соответствовала требованиям, предъявляемым к средствам, претендующим на роль гемостимуляторов [11]. Однако эффективность данного препарата в большей степени проявлялась в отношении эритропоэза и была существенно менее значимая (несоизмерима с эффективностью терапии препаратом Г-КСФ) в отношении грануломоноцитарного ростка кроветворения.

Максимально выраженными изменения регенераторного характера были со стороны обоих ростков кроветворения при совместном применении гиалуронидазы и Г-КСФ. При моделировании цитостатической миелосупрессии препараты гиалуронидазы и Г-КСФ усиливали специфическое гемопоэзстимулирующее действие друг друга. Содержание КОЕ-ГМ в костном мозге на 4, 8-е сут превосходило аналогичные параметры при введении только Г-КСФ (в 1,8 и 1,5 раза соответственно), а количество КОЕ-Э значительно превышало значения соответствующего показателя при назначении одного препарата гиалуронидазы (в 1,44 и 1,5 раза на 4 и 10-е сут соответственно). Изменения состояния пулов родоначальных клеток закономерно сопровождались и более выраженными регенераторными сдвигами со стороны картины костного мозга и периферической крови. Имело место более значимое увеличение числа незрелых (6, 10-е сут, с максимумом в 1,8 раза на 10-е сут) и зрелых (4, 6, 10-е сут, с максимумом в 1,7 раза на 8-е сут опыта) нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и палочко- (8, 14-е сут) и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови (6, 8-е сут опыта), чем при введении одного Г-КСФ при миелосупрессии, а также более значительное, чем при введении только гиалуронидазы, увеличение количества эритрокариоцитов в гемопоэтической ткани на 4, 6, 8, 14-е сут (почти в 2 раза в начальные сроки), а также ретикулоцитов (в 1,74 и 1,5 раза на 8, 10-е сут соответственно) и эритроцитов в периферической крови (10, 14-е сут) (табл.2).

Таким образом, при совместном применении гиалуронидазы и Г-КСФ наблюдалось значительное усиление специфических гемостимулирующих свойств, характерных для каждого из препаратов в отдельности. Указанная комбинация средств приводила к выраженному ускорению регенераторных процессов гемопоэтической ткани после моделирования цитостатической миелосупрессии, большинство показателей которых значительно превосходили скорость восстановления и степень гиперплазии эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения по сравнению с проведением монотерапии препаратами гиалуронидазы и Г-КСФ.

Механизмом повышения уровня стимуляции гемопоэза у интактных мышей и ускорения регенерации кроветворной ткани у животных после цитостатического воздействия, очевидно, являлось потенцирование гематотропных эффектов Г-КСФ и гиалуронидазы под действием друг друга. Данное обстоятельство, вероятно, определялось изменением свойств межклеточного матрикса и модификацией чувствительности кроветворных прекурсоров под влиянием фермента к цитокинам (в первую очередь эритроидных клеток-предшественников к вводимому извне Г-КСФ), а также синергичностью действия обоих препаратов в отношении грануломоноцитарного ростка кроветворения, по-видимому, связанной с уникальной способностью гиалуронидазы увеличивать резерв МСК в организме [12], способных дифференцироваться в кроветворные прекурсоры при осуществлении заявленного способа.

Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать миелопоэз как в условиях оптимальной жизнедеятельности, так и при миелосупрессирующих воздействиях.

Литература

12.-С.690-695.

2. Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S. е.а. CD44 and hyaluronic acid cooperate with SDF-1 in the trafficking of human CD34⁺8. – P.2981-2989.

12. – P.105-115.

21. – P.25-29.

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. – С.15-17, 47-48.

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. – Томск, 1999. -114 с.

7. Регистр лекарственных средств. Энциклопедия лекарств. – Изд-во ООО «РЛС – 2004», 2004. – 1503 с.

4. – С.230-233.

9. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Под ред. В.В. Меньшикова, М. – 1987. -152 с.

10. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. – Томск: Изд-во ТТУ, 1992. – С.130-145.

1(9). – С.29-32.

2. – С.115-119.

Формула изобретения

Способ стимуляции миелопоэза, заключающийся во введении гиалуронидазы внутрибрюшинно в дозе 1000 УЕ/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней, отличающийся тем, что дополнительно вводят препарат рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора подкожно в дозе 125 мкг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней.