Патент на изобретение №2366429
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства, не содержащего живых микроорганизмов, способного оказывать благоприятное действие на организм человека через стимуляцию роста представителей симбионтной микрофлоры кишечника, являющегося субстратным и энергетическим материалом для нормальной микрофлоры. Предложено применение низкоэтерифицированного пектата кальция со степенью этерификации – 1,2%, молекулярной массой – 39,3 кДа в качестве пребиотического средства. Технический результат заключается в расширении арсенала пребиотических средств, способных оказывать благоприятное действие на организм человека через стимуляцию роста представителей симбионтной микрофлоры кишечника, создания условий для собственно пробиотиков, снижение численности патогенной микрофлоры. 4 табл.
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства, способного оказывать благоприятное действие на организм человека через стимуляцию роста представителей симбионтной микрофлоры кишечника, снижать численность патогенной микрофлоры. Известны препараты, проявляющие пребиотические свойства – лактулоза (дюфалак), хилак-форте, эубикор, свойствам пребиотиков отвечают инулин, лактилол, галактоолигосахариды, фруктоолигосахариды [1, 3, 4]. Наиболее близким (прототипом) является лекарственное средство – эубикор, обладающее как пребиотическим, так и энтеросорбционным действием. Эубикор позволяет в более ранние сроки добиться снижения выраженности клинических симптомов дисбактериоза, обладает антиаллергическим эффектом, антиоксидантной активностью [4]. Задачей изобретения является расширение арсенала пребиотических средств, способных оказывать не только благоприятное действие на организм человека через стимуляцию роста представителей симбионтной микрофлоры кишечника, создания условий для собственно пробиотиков, но и одновременного снижения численности патогенной микрофлоры. Доказано, что известные бифидогенные факторы (галактоолигосахариды, фруктоолигосахариды и т.д.) в основном метаболизируются лактобактериями и бифидобактериями, что является оптимальным подходом к коррекции дисбиозов. Но, при известных условиях (прием антибиотиков, вирусные и антибактериальные инфекции, стресс и т.д.) происходят нарушения в составе и функциях нормальной и сапрофитной микрофлоры, индуцируемые возбудителями кишечных заболеваний и ростом условно-патогенных микроорганизмов. Поэтому создание адекватного пребиотика для разных клинических ситуаций (лучевая болезнь, применение химиотерапии и антибиотиков, хронические воспалительные и аллергические заболевания) является насущным и перспективным направлением для отечественной фармацевтической промышленности. Кроме того, необходимо отметить отсутствие отечественных лекарственных препаратов с таким комплексным действием (пребиотическим и бактериостатическим), а в составе БАД встречаются, главным образом, нестандартизованные полисахариды. Поставленная задача достигается использованием в качестве пребиотического средства низкоэтерифицированного некрахмального полисахарида со степенью этерификации – 1,2%, молекулярной массой – 39,3 кДа – пектата кальция, полученного из коммерческого цитрусового высокоэтерифицированного пектина (Copenhagen Pectin A/S, Lille Scensved, Дания). Пектат кальция представляет собой сухой белый порошок и имеет следующие физико-химические характеристики: содержание ангидрогалактуроновой кислоты – 67,3% и кальция – 38 мг/г образца, степень этерификации – 1,2%, молекулярная масса – 39,3 кДа. Пектат кальция получали из коммерческого пищевого цитрусового пектина методом ионного обмена в неводной среде. На первом этапе проводили щелочную деэтерификацию пектина. Для этого 100 г пектина суспендировали в 500 мл 50 об.% этанола, нагретого до 40°С. Смесь перемешивали при данной температуре в течение 25-30 мин и фильтровали через бязевый фильтр под вакуумом. Пектин на фильтре промывали 400 мл 50 об.% этанола. Промытый пектин суспендировали в 500 мл 50 об.% этанола и термостатировали при температуре 10-15°С. Затем к смеси добавляли 0,02 г индикатора тимолфталеина и при постоянном перемешивании, постепенно, порциями по 50 мл добавляли 1 М раствор NaOH в 50 об.% этаноле. Каждую последующую порцию NaOH добавляли только после обесцвечивания окраски индикатора. Температуру смеси поддерживали в диапазоне 10-15°С. Процесс заканчивали, когда после добавления очередной порции NaOH не происходило изменение окраски индикатора в течение 1 часа. По окончании процесса полученную смесь нейтрализовали добавлением 100 мл 1 М раствора HCl в 50 об.% этаноле, фильтровали через бязевый фильтр под вакуумом и затем промывали 400 мл 50 об.% этанола. На втором этапе промытый пектин суспендировали в 500 мл 50 об.% этанола и при непрерывном перемешивании постепенно добавляли 20 г хлористого кальция, растворенного в 200 мл 50 об.% этанола. Смесь перемешивали еще в течение 20 минут и фильтровали через бязевый фильтр под вакуумом. Образовавшийся пектат кальция промывали на фильтре последовательно 400 мл 50 об.% этанола, 200 мл 70 об.% этанола и 200 мл 95 об.% этанола. Промытый пектат кальция сушили при 80°С до остаточной влажности не более 6%. Катион-связывающая способность пектинов обусловлена наличием в их структуре неэтерифицированных карбоксильных групп остатков галактуроновой кислоты [6]. Деметилированные пектины формируют гель в присутствии кальция благодаря образованию ионных поперечных связей между цепями гомогалактурононана. Механизм гелеобразования до конца не ясен, хотя одна из возможных моделей (“egg-box”) заслуживает внимания. Согласно данной модели поперечно-сшитые контактные зоны предположительно формируются между кальцием и, как минимум, шестью смежными неэтерифицированными остатками галактуроновой кислоты. В результате образуется полимерная сеть, обладающая способностью удерживать молекулы воды. Гелеобразующая способность пектинов и его физико-химические свойства определяются степенью этерификации карбоксильных групп галактуроновой кислоты и их взаимодействием с двухвалентными электронами, преимущественно с кальцием. Низкая степень этерификации (1,2%) и молекулярная масса (39,3 кДа) пектата кальция, полученного в результате направленной химической трансформации, позволили получить выраженный пребиотический эффект на штаммах Escherichia coli (непатогенный), бифидо- и лактобактерий. Вышесказанное вполне вписывается в рамки существующей концепции о преимущественной активности в качестве пребиотиков полисахаридов с короткой цепью. Сравнительное изучение этой группы веществ показало, что чем короче цепь полисахаридов, тем меньше специфичность, а соответственно, эффективность ферментации определенными микроорганизмами кишечника. Известны экспериментальные данные по оценке сорбционной активности пектата кальция, которые позволяют рекомендовать препараты на его основе для клинических исследований с целью создания новых средств профилактики и фармакотерапии хронических отравлений тяжелыми металлами [5, 6]. Пектат кальция проявляет максимальную металлосвязывающую активность, сравнимую с полифепаном и активированным углем. Препараты на его основе могут применяться энтерально в течение длительного периода времени без риска возникновения нежелательных эффектов для фармакологической коррекции функциональных нарушений внутренних органов, вызванных неблагоприятной экологической обстановкой. Резюмируя вышеприведенные данные можно утверждать о сходных с эубикором фармакологических эффектах: энтеросорбционным, антиаллергическим, антиоксидантным. Стандартизованный пектат кальция повышает резистентность слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки животных к агрессивным факторам ульцерогенеза при лечебно-профилактическом внутрижелудочном введении [2, 5]. При этом гастрозащитная активность пектата кальция была сопоставима или превосходила эффекты препаратов сравнения: фамотидина, масла облепихового, маалокса на различных модельных системах. Показано, что пектат кальция физиологически оптимально стимулирует моторно-эвакуаторную функцию желудочно-кишечного тракта животных в норме и при язвенной патологии, обладает умеренным спазмолитическим эффектом, сравнимым с действием дротаверина. Принципиально новым в предлагаемом изобретении является то, что низкоэтерифицированный пектат кальция (степень этерификации – 1,2%, молекулярная масса – 39,3 кДа) применяется в качестве средства, не содержащего живых микроорганизмов, способного не только стимулировать рост представителей симбионтной микрофлоры кишечника, подавлять численность патогенной микрофлоры in vitro. Использование некрахмального полисахарида пектата кальция как пребиотического средства в литературе не описано. Эти новые свойства пектата кальция явным образом не вытекают из уровня техники и не очевидны для специалиста. Низкоэтерифицированный пектат кальция может быть использован в терапии дисбактериоза кишечника – клинико-лабораторного синдрома, возникающего при целом ряде патологических состояний и факторов риска, назначаться как в сочетании с собственно пробиотиками, так и в виде монотерапии. Препарат может выпускаться в лекарственной форме и в виде биологически активных добавок. Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленно применимо». Новые свойства препарата были найдены экспериментальным путем. Изобретение будет понятно из следующего описания. В качестве тест-объектов использованы музейные штаммы Escherichia coli (непатогенный), Candida albicans, полученные из музея культур кафедры микробиологии СибГМУ, обладающие всеми типичными свойствами для данного вида микроорганизмов. Штаммы бифидо- и лактобактерий получены из сухого стандартизованного порошка производства НПО «Вирион» (г.Томск) путем разведения и трехкратного пересева с последующей окраской по Граму и идентификацией под микроскопом. Для посева культур были использованы стандартизованные питательные среды: бифидоагар, мясопептонный агар и бульон, среда Сабуро. Питательные среды готовили в соответствии с прилагающимися инструкциями. Постановка экспериментов по изучению влияния пектата кальция на рост штаммов Esherichia coli и Candida albicans Для посева были использованы суточные культуры микроорганизмов в разведении 500 микробных тел (по стандарту мутности), которые контролировали микроскопически. К взвеси микроорганизмов в мясопептонном бульоне был добавлен стерильный физиологический раствор (контрольные пробирки) или раствор пектата кальция (на физ. растворе) в концентрации 2% и 4%. Для достоверности результатов пробирки дублировались. Через 4, 24 и 48 ч производили посев культур из пробирок на чашки Петри в количестве 0,05 мл, стеклянным стерильным шпателем равномерно распределяя по поверхности питательной среды (для Е. coli – мясопептонный агар, для С. albicans – среда Сабуро), посев помещали в термостат с температурой 37°С на 24 ч. По истечении суток подсчитывали количество выросших колоний на 1 см2 (по 4 измерения на чашку) и пересчитывали на площадь чашки (×78,5). Чистоту культур микроорганизмов контролировали под микроскопом. Постановка экспериментов по изучению влияния пектата кальция на рост штаммов бифидо- и лактобактерий Для посева были использованы суточные культуры микроорганизмов в разведениях (по стандарту мутности): 500000, 50000, 5000, 500, 50 и 5 микробных тел (для бифидокультуры) и 5000, 500, 50 и 5 микробных тел (для лактокультуры), помещенные в пробирки с 9 мл полужидкой бифидум-среды, к которым был добавлен физ. раствор или раствор пектата кальция в концентрации 2 и 4%. Для достоверности результатов пробирки дублировались. Затем через 4, 24 и 48 ч бактериологической петлей производили посев культур в стерильные пробирки с бифидум-средой однократным прокалыванием от уровня среды до дна пробирки. Посев помещали в термостат с температурой 37°С на 24 ч. По истечении суток производили визуальную оценку роста, фиксируя его наличие/отсутствие и степень выраженности (в «+» от 1 до 5). Чистоту культур микроорганизмов контролировали под микроскопом. Результаты исследований представлены в примерах 1-4. Пример 1. Для определения действия пектата кальция на рост нормальной микрофлоры исследовали влияние полисахарида на рост непатогенного штамма Escherichia coli. В результате эксперимента выявлено повышение количества выросших колоний кишечной палочки в чашке Петри при использовании пектата кальция. Так, разведение полисахарида в концентрациях 2 и 4% через 4 ч экспозиции приводило к достоверному увеличению числа колоний в 1,97 и 1,83 раза соответственно, через 24 ч – в 1,94 и 1,81 раза соответственно, а через 48 ч наблюдалось увеличение числа колоний в 3,5 и 1,2 раза соответственно относительно контрольных значений (табл.1).
Таким образом, в результате эксперимента выявлена стимуляция роста нормальной микрофлоры через 4, 24 и 48 ч экспозиции, более выраженная при использовании пектата кальция в концентрации 2%. Пример 2. Для определения наличия пребиотического действия было исследовано влияние пектата кальция на рост культур бифидобактерий. В результате эксперимента было показано стимулирующее действие пектата кальция на рост колоний бифидобактерий. Так, добавление пектата кальция в концентрации 2% в пробирки с кратными разведениями бифидокультуры стимулировало рост микроорганизмов в концентрациях 50000 «++» и 5000 «++» микробных тел через 24 ч, в концентрациях 5000 «++» и 500 «++» микробных тел – через 48 ч экспозиции по сравнению с « – » контроля. При использовании 4% пектата кальция отмечалась степень роста микроорганизмов «++» в концентрациях 50000 и 5000 микробных тел через 24 ч и 5000 «++», 500 «++», 50 «+» и 5 «+» микробных тел – через 48 ч по сравнению со степенью роста « – » контроля (табл.2).
Пример 3. Для подтверждения наличия пребиотического действия было исследовано влияние пектата кальция на рост культур лактобактерий. Добавление 2% пектата кальция в пробирки с кратными разведениями лактобактерий также приводило к стимуляции роста штамма в концентрации 5 микробных тел через 24 ч экспозициии, когда отмечалось отсутствие роста микроорганизмов в контроле (табл.3). При использовании 4% пектата кальция наблюдалась стимуляция роста колоний «+» в концентрациях 500 и 50 микробных тел через 4 ч и в концентрациях 5000 «+++++» против «+++», 500 «++++» против «+++», 50 «++++» против «++» и 5 «+++» против «+» микробных тел, «++» на фоне « – » контрольных значений – через 24 ч экспозиции. Аналогичная картина наблюдалась при использовании 4% пектата кальция через 48 ч экспозиции.
Таким образом, пектат кальция обладает пребиотическим действием, причем с увеличением концентрации степень выраженности эффекта увеличивается. Пример 4. С целью изучения влияния пектата кальция на рост патогенной микрофлоры кишечника исследовано действие полисахарида на рост культуры Candida albicans. В результате эксперимента было показано бактериостатическое действие пектата кальция, проявившееся в снижении количества выросших колоний в чашке Петри со средой Сабуро. Так, при использовании полисахарида в концентрации 2% количество колоний через 24 ч экспозиции достоверно снижалось в 1,3 раза (табл.4). Применение пектата кальция в концентрации 4% приводило к уменьшению числа колоний в 1,7 раза через 24 ч и в 1,6 раза – через 48 ч экспозиции.
Таким образом, выявлено бактериостатическое действие пектата кальция на рост патогенной микрофлоры на примере Candida albicans, более выраженное при использовании концентрации 4%. Резюмируя вышесказанное, можно сделать вывод о возможности расширения арсенала пребиотических средств за счет применения низкоэтерифицированного пектата кальция, способного стимулировать рост симбиотической микрофлоры кишечника, подавлять численность патогенной микрофлоры in vitro. Литература
6. Сергущенко И.С. Сравнительная оценка металлсвязывающей активности некрахмальных полисахаридов: Автореферат дис.
Формула изобретения
Применение низкоэтерифицированного пектата кальция со степенью этерификации 1,2%, молекулярной массой 39,3 кДа в качестве пребиотического средства.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
канд. мед. наук. – Владивосток, 2004. – 24 с.