Патент на изобретение №2364866
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
(57) Реферат:
Изобретение относится к клинической лабораторной диагностике и может быть использовано для определения резистентности эритроцитов пациентов при различных заболеваниях, а также для оценки результатов терапии и при изучении действия эффекторов эритроцитарной мембраны. Способ заключается в ресуспендировании отмытых от плазмы эритроцитов в физиологичной среде, обработке каналоформером нистатином (5,5·10-5-3·10-4 M), при этом определение резистентности эритроцитов по интегральному выходу K+ из клеток проводят в период времени от 25 до 35 минуты от внесения нистатина в пробу. В качестве физиологичной среды используют солевой раствор с осмолярностью 240-290 мосм/л, содержащий KCL в количестве 4-5 ммоль/л и NaCL в количестве 104-141 ммоль/л, а также можно использовать аутологичную плазму крови. Изобретение обеспечивает возможность оценки состояния билипидного слоя эритроцитарных мембран в способе определения резистентности эритроцитов. 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 ил.
Изобретение относится к клинической лабораторной диагностике и может быть использовано для определения резистентности эритроцитов пациентов при различных заболеваниях, для оценки результатов терапии, при изучении действия эффекторов эритроцитарной мембраны.
Известен способ определения общей резистентности эритроцитов, включающий осмотический гемолиз. В качестве гипотонического раствора используют 0,45% раствор хлористого натрия и регистрируют светопоглощение с временным интервалом 15 секунд до момента пятикратного повторения одного и того же значения, которое обозначают как длительность осмотического гемолиза t (Медицинские и лабораторные технологии. Справочник. / Под общ. ред. А.И. Карпищенко. – СПб.: Интермедика, 1998. – Т.1. – С.283-284). Резистентность эритроцитов (Rэр) оценивают по формуле Rэр=(m-d)/(h-d)·100%, где m – остаточное светопоглощение осмотического гемолиза; d – остаточное светопоглощение кислотного гемолиза; h – исходное светопоглощение осмотического гемолиза Способ позволяет определить общую осмотическую устойчивость эритроцитарных плазматических мембран в гипоосмоляльной среде. К недостаткам способа, как и в случае кислотного гемолиза, следует отнести невозможность оценки качества билипидного мембранного слоя. Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в оценке состояния билипидного слоя эритроцитарных мембран. Сущность изобретения заключается в достижении заявленного технического результата в способе определения резистентности эритроцитов, включающем ресуспендирование отмытых от плазмы эритроцитов в физиологичной среде, обработку каналоформером, обеспечивающую формирование неселективных гидрофильных трансмембранных каналов, и определение резистентности по внеклеточной концентрации определяемого иона. Целесообразно в качестве каналоформера использовать нистатин в концентрации 5,5·10-5-3·10-4 M, а резистентность определять по интегральному выходу K+ из клеток в период времени от 25 до 35 минуты с момента внесения нистатина в пробу. Целесообразно в качестве физиологичной среды использовать солевой раствор с осмолярностью 240-290 мосм/л, содержащий KCl в количестве 4-5 ммоль/л и NaCl в количестве 104-141 ммоль/л. Также целесообразно в качестве физиологичной среды использовать аутологичную плазму крови. Проведенные авторами исследования показали, что резистентность эритроцитарной мембраны по отношению к внешнему воздействию каналоформера может быть использована как критерий для оценки состояния билипидного слоя эритроцитарных мембран. Неселективные нистатиновые каналы могут быть сформированы только в холестерин-содержащей мембране, поскольку для организации гидрофильной структуры требуется последовательная сборка молекул полиена и стерана, таким образом, существование указанных структур возможно лишь в пределах билипидного слоя. В процессе построения канала не затрагивается цитоскелет мембраны эритроцита, а также другие ее структуры. Поскольку скорость изменения внеклеточной концентрации K+ напрямую зависит от количества организованных в эритроцитарной мембране каналов и, следовательно, от концентрации каналоформера в пробе, определение проводили в оптимальном диапазоне концентраций нистатина – 5,5·10-5-3·10-4 М, которая явилась оптимальной для полной регистрации кинетической зависимости. Продолжительность эксперимента в этих условиях составляет примерно 1 час от момента внесения нистатина в пробу. Допустимо использование в качестве каналоформера также аламетицина, грамицидина или амфотерицина В. Для оценки резистентности эритроцитов наиболее адекватным оказался временной интервал от 25-й до 35-й минуты от начала воздействия каналоформера, так как этот период соответствует стабилизации транспортных процессов в мембране. Использование в качестве внеклеточной среды солевого раствора с осмолярностью 240-290 мосм/л, содержащего KCl в концентрации 4-5 ммоль/л и NaCl в концентрации 104-141 ммоль/л обеспечивает наиболее адекватную имитацию условий, в которых эритроцит функционирует in vivo. Использование в качестве наиболее физиологичной среды аутологичной плазмы крови позволяет оценить состояние мембраны, взаимодействующей с активными компонентами естественной среды пребывания эритроцита. Это позволяет, например, характеризовать происходящее во время диализной процедуры взаимное влияние трансформированных молекул, находящихся на внешней поверхности эритроцитарной мембрваны, и «очищенного» в процессе детоксикации комплекса веществ жидкой фазы. На чертеже представлена кривая зависимости нормированной концентрации K+ от времени. Способ осуществляют, например, следующим образом. Эритроциты отделяют от плазмы однократным центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин, 4°С); затем отмывают солевым раствором. Для этого может быть использован общеизвестный раствор Тироде (раствор Т) или раствор, предложенный в работе [Cumberbatch M., Zareian К., Morgan D.B., Swamihathan R. The relationship between sodium transport and Na+, K+
По 1 мл полученной эритроцитарной массы переносят в ячейки и добавляют либо 0,5 мл раствора Т или М, либо 0,5 мл аутологичной плазмы. В качестве каналоформера – провокатора трансмембранных потоков Na+ и K+ используют нистатин: 0,04 мл его раствора в перегнанном ДМФА с концентрацией 1-5 мг/мл (5,5·10-5-3,0·10-4 М) вносят в ячейку для индуцирования интенсивного выхода внутриклеточного K+ во внешнюю среду по сформированным каналам. Концентрация нистатина в пробе, таким образом, составляет 0,044-0,222 мг/мл внеклеточной жидкости (4,68·10-5-2,34·10-4 М). Для регистрации внеклеточных концентраций Na+ и K+ может быть использована известная установка (Борисов Ю.А., Соболева О.Ю., Суглобова Е.Д., Щербак А.И. Ионометрическое изучение потоков Na+ и K+ Для определения интегрального выхода К+ вычисляют площадь области диаграммы (см. чертеж), расположенную под кривой зависимости нормированной концентрации K+ от времени в интервале от 25-й до 35-й минуты. По заявленному способу обследовали группу из 147 человек (78 мужчин и 69 женщин, средний возраст – 43,9±1,4 года), получавших заместительную терапию регулярным гемодиализом. Контрольной группой служили добровольцы (12 мужчин и 12 женщин, средний возраст – 42,3±1,3 года). По возрастному и половому составу исследуемая и контрольная группы достоверно не отличались друг от друга (t=1,09; Эритроциты из свежей гепаринизированной крови пациентов гемодиализа (взятой до и после сеанса) и здоровых доноров отделяли от плазмы путем центрифугирования (3000 об/мин, 4°С, центрифуга РС-6) в течение 10 мин. Полученный осадок эритроцитов дважды отмывали от плазмы раствором М при центрифугировании в прежних условиях. По 1 мл полученной эритроцитарной массы переносили в ячейки и добавляли либо 0,5 мл раствора М, либо 0,5 мл аутологичной плазмы, в зависимости от условий эксперимента. В качестве провокатора трансмембранных потоков Na+ и K+ использовали нистатин – каналоформер, антибиотик полиенового ряда. 0,04 мл его раствора в перегнанном ДМФА концентрацией 5 мг/мл (3,0·10-4 М) вносили в ячейку для индуцирования интенсивного выхода внутриклеточного K+ во внешнюю среду по сформированным каналам. Концентрация нистатина в пробе, таким образом, составляла 0,222 мг/мл внеклеточной жидкости. В качестве ячеек применялись фторопластовые бюксы с внутренним диаметром 12 мм, в пластиковых крышках которых закреплялись либо ионоселективные электроды (диаметр корпусов 4 мм), либо ISFET (пластина толщиной 0,8 мм), и электролитические мостики. Ячейки помещали в жидкостной термостат 1ТЖ-003, снабженный шейкером; все определения, как и предварительные калибровки датчиков, производили при 37°С. Для оценки резистентности эритроцитов по отношению к нистатину использовали интегральный выход K+, который рассчитывали следующим образом: 1. Нормировка внеклеточной концентрации K+. Несмотря на то, что рабочие ячейки готовили стандартно, и количество эритроцитов в пробах одной серии было примерно одинаковым (в каждой ячейке определяли значение гематокрита), для нивелирования возникающих различий фиксируемую в каждый следующий момент величину концентрации K+ относили к конечному (лизисному) значению. 2. При определении интегрального выхода K+ вычисляли площадь области диаграммы, расположенную под кривой зависимости нормированной концентрации K+ от времени в интервале от 25-й до 35-й минуты от начала воздействия каналоформера (см. чертеж). При исследовании резистентности эритроцитов в качестве эффектора эритроцитарной мембраны использовали уабаин – специфический ингибитор Na+, K+-АТФазы. 0,04 мл его раствора в деионизированной воде (14,6 мг/мл деионизированной воды) добавляли в ячейку за 10 мин до внесения туда раствора нистатина. В ячейки, куда уабаин не добавлялся, вносили 0,04 мл деионизированной воды. В таблице 2 представлены значения резистентности эритроцитов контрольной группы здоровых доноров (n=24). В первом столбце приведены результаты экспериментов, в ходе которых суспензию клеток, отмытых солевым раствором, ресуспендировали в растворе М (столбец Ny). Во втором столбце приведены результаты экспериментов, в ходе которых отмытые от плазмы эритроциты, ресуспендированные в растворе М, перед внесением нистатина предварительно экспонировали с уабаином в течение 10 минут (столбец Ou+Ny). В столбце 3 – результаты экспериментов, в ходе которых суспензию клеток, отмытых солевым раствором, ресуспендировали в аутологичной плазме (столбец Pl+Ny).
Как следует из данных, представленных в таблице 2, наблюдалось 14%-ное увеличение скорости выхода K+ по сформированным каналам в пробе с уабаином, по сравнению с пробами, в которых отсутствовал специфический ингибитор Na+, K+-АТФазы. Распределение величин интегрального нормированного выхода K+ для контрольной группы здоровых доноров является нормальным; проведенное сравнение по Стьюденту (попарно сопряженные коварианты) показало высокую достоверность описанных изменений. Интенсивность выхода K+ из клеток, ресуспендированных в модельном растворе М, оказалась в 2,5-3 раза выше, чем эта же величина для проб, в которые добавляли плазму крови. Различия между зафиксированными интегральными величинами высокодостоверны (см. табл.2). В таблице 3 представлены значения резистентности эритроцитов здоровых доноров и эритроцитов пациентов гемодиализа до и после сеанса.
Показатели резистентности у пациентов гемодиализа превышали соответствующие величины для здоровых доноров в 1,3-1,4 раза, и в данном случае различия в каналоформерной резистентности стали достоверными (см. табл.3). В таблице 4 представлены значения резистентности эритроцитов здоровых доноров и эритроцитов пациентов гемодиализа до и после сеанса при ресуспендировании клеток в аутологичной плазме.
Из приведенных в таблице 4 данных следует, что при ресуспендировании эритроцитов в аутологичной плазме характерным оказалось значительное отличие в нормированном выходе K+ у больных перед гемодиализной процедурой по сравнению со здоровыми донорами на фоне отсутствия достоверной разницы по этому показателю между донорами и пациентами после сеанса, а при сравнении величин (Pl+Ny)до=153,0±12,2 и (Pl+Ny)после=124,7±8,4 р2,3 оказалась равной 0,055, что весьма близко к критерию достоверности. Были проанализированы разностные величины интегрального нормированного выхода K+ при ресуспендировании эритроцитов в растворе М и при ресуспендировании клеток с добавлением аутологичной плазмы крови (таблица 5). Именно эти переменные характеризуют состояние плазматической мембраны отмытых от плазмы клеток при отсутствии нативного окружения и состояние мембраны, взаимодействующей с активными компонентами естественной среды пребывания эритроцита. Возможность регистрации изменений, происходящих во время диализной процедуры, имеет особую важность, поскольку они отражают модификации поверхностных слоев при движении по экстракорпоральной системе кровообращения и взаимное влияние трансформированных молекул, находящихся на внешней поверхности, и «очищенного» в процессе детоксикации комплекса веществ жидкой фазы.
Как видно из представленных данных, рассматриваемые разностные величины оказались достаточно высокими и значимыми, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблице 5. Использование заявленного способа позволяет оценить состояние билипидного слоя эритроцитарных мембран.
Формула изобретения
1. Способ определения резистентности эритроцитов, включающий ресуспендирование отмытых от плазмы эритроцитов в физиологичной среде, обработку каналоформером нистатином в концентрации 5,5·10-5-3·10-4 М и определение резистентности по интегральному выходу К+ из клеток в период времени от 25 до 35 мин от внесения нистатина в пробу. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве физиологичной среды используют солевой раствор с осмолярностью 240-290 мосм/л, содержащий KCl в количестве 4-5 ммоль/л и NaCl в количестве 104-141 ммоль/л. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве физиологичной среды используют аутологичную плазму крови.
РИСУНКИ
HE4A – Изменение адреса для переписки с обладателем патента Российской Федерации на изобретение
Новый адрес для переписки с патентообладателем:
Извещение опубликовано: 20.09.2009 БИ: 26/2009
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1, с.24-32. Ионометрическое изучение потоков Na+ и K+ через мембрану эритроцитов человека, модифицированную нистатином. Медицинские и лабораторные технологии. Справочник. / Под общ. ред. А.И.Карпищенко. – СПб.: Интермедика, 1998, т.1, с.283-284. ARMSBY CC et al. Resistance to osmotic lysis in BXD-31mouse erythrocytes: asaociation with upregulated K-CL cotransport. Am J Physiol, 1996 Mar; 270(3 Pt 1): c.866-77. PMID: 8638668. RU 2162698 C2, 10.02.2001. SU 542947 A1, 15.01.1977. SU 1097949 A1, 15.06.1984. SU 1469464 A1, 30.03.1989. SU 1220636 A1, 30.03.1986. BIN Talib HK et al. Red cell ouabain-resistant Na+ and K+ transport in Wistar, Brown Norway and spontaneously hypertensive rats. Physiol Res, 1993; 42(6):181-8. PMID: 8180150.
2=0,001 соответственно).
