Патент на изобретение №2360966

(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus L. – ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ АЛЬФА2-МИКРОГЛОБУЛИНА ФЕРТИЛЬНОСТИ (АМГФ)/ГЛИКОДЕЛИНА, РЕАГИРУЮЩИХ С РАЗЛИЧНЫМИ ГЛИКОФОРМАМИ БЕЛКА

(57) Реферат:

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм А-4А7 получен путем слияния клеток мышиной миеломы линии SP2/0.Ag14 с лимфоцитами мышей линии Balb/c, иммунизированных введением в подушечки лап очищенного препарата АМГФ (альфа2-микроглобулина фертильности), выделенного из амниотической жидкости, и депонирован в коллекции перевиваемых культур клеток млекопитающих ГУ НИИ морфологии человека РАМН под номером 131/2002. Штамм А-4А7 синтезирует моноклональные антитела (МКА) класса IgGI, специфически взаимодействующие в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с изоформами АМГФ эндометриального, фолликулярного и спермального происхождения. Активность штамма: культуральный супернатант содержит 3-5 мкг/мл МКА, асцитная жидкость – 2-5 мг/мл МКА. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:500-1:1000, в асцитной жидкости до 1:1×10⁷. А-4А7 связывает различные гликоформы белка АМГФ, продуцируемые в органах мужской и женской репродуктивной системы. Использование МКА А-4А7 как иммунодиагностической тест-системы позволяет проводить количественные определения разных изоформ АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях с высокой специфичностью и чувствительностью (1 нг/мл).

Использование: биотехнология, репродуктивная медицина.

Сущность изобретения: Штамм получен путем слияния клеток мышиной миеломы SP2/0.Agl4 с клетками лимфоузлов мышей линии Balb/c, иммунизированных введением в подушечки лап очищенного препарата АМГФ, выделенного из амниотической жидкости. Селекция гибридом проведена на среде HAT. Штамм синтезирует моноклональные (МКА) антитела, специфически взаимодействующие с АМГФ в твердофазном иммуноферментном анализе. Титр антител в культуральной жидкости составляет 1:500-1:1000, в асцитной жидкости до 1:1×10⁷. Моноклональные антитела могут быть использованы для конструирования иммунобиотехнологических тест-систем для количественного определения АМГФ в биологических жидкостях.

Белок АМГФ/гликоделин – гликопротеин представляет собой гомодимерный комплекс с молекулярной массой 50-60 кДа и молекулярной массой субъединиц 28 кДа. В 1976-1985 гг.несколькими независимыми группами исследователей белок был выделен из ранней плаценты человека, децидуальной оболочки, амниотической жидкости, семенной плазмы и охарактеризован под разными наименованиями в зависимости от источника и физико-химических свойств: плацентарный 2-глобулин (Петрунин Д.Д., Грязнова И.М., Петрунина Ю.П., Татаринов Ю.С. Иммунохимическая идентификация органоспецифического 2-глобулина плаценты человека и его содержание в амниотической жидкости. БЭБиМ, 1976, 7, с.803); 2-микроглобулин фертильности (Петрунин Д.Д., Пшеничникова Т.Я., Шевченко О.П., Пиганова Н.Л. Иммунохимическое исследование 2-микроглобулина фертильности в эндометрии. Акуш. и гин., 1983, 9, с.27-28); плацентарный протеин 14, РР14 (Bohn H., Kraus W., Winckler W. New soluble placental tissue proteins: their isolation, characterization, localization and quantification. In: “Immunology of Human Placental Proteins”, ed. Klopper. Placental Suppl (4) Praeger, NY, 1982, p.67-82); эндометриальный 2-глобулин, 2-PEG (Bell S.C., Hales M.W., Patel S., Kiwan P.H. Protein synthesis and secretion by the human endometrium and decidua during early pregnancy. Br. J. Obstet. GynaecoL, 1985a, v. 92, p.793-803); ассоциированный с беременностью эндометриальный протеин 15, ЕР15 (Bell S.C., Patel S., Hales M.W. Immunochemical detection and characterization of pregnancy-associated endometrial alpha-globulins secreted by the human endometrium. J.Reprod. Fertil., 1985b, v.74, p.261); прогестаген-зависимый эндометриальный белок, PEP (Joshi S.G., Ebert K.M., Swartz D.R. Detection and synthesis of a progestogen-dependent protein in human endometrium. J.Reprod. Fertil., 1980, v.59, p.273); -маточный белок, AUP (Sutcliff R.G., Joshi S.C., Patterson W.F. Serological identity between human alpha-uterine protein and human progestogen-dependent endometrial protein. J.Reprod. Fertil., 1982, v.65, p.207). В иммунологических тестах была установлена антигенная идентичность этих белков (Bonn H., Kraus W., Winckler W. New soluble placental tissue proteins: their isolation, characterization, localization and quantification. In: “Immunology of Human Placental Proteins”, ed. Klopper. Placenta Suppl (4) Praeger, NY, 1982, p.67-82; Bell S.C., Bohn H. Immunochemical and biochemical relationship between human pregnancy-associated secreted endometrial alphal- and alpha2-globulins (alpha1- and alpha2-PEG) and the soluble placental proteins 12 and 14 (PP12 and PP14). Placenta, 1986, v.7, N4, p.283-294). Для унификации номенклатуры Dell и соавт.(Dell A., Morris H.R., Easton R.L. Structural analysis of the oligosaccharides derived from glycoprotein with potent immunosuppressive and contraceptive activities. J. Biol. Chem., 1995, v.270, N41, p.24116-24125) предложили современное обозначение “гликоделин”, отражающее уникальное свойство белка – зависимое от пола гликозилирование и наличие его различных гликоформ в зависимости от источника продукции: аминиотической – гликоделин-А, спермальной – гликоделин-S (Seppala M., Taylor R.N., Koistinen H., Koistinen R., Milgrom E. Glycodelin: A major lipocalin protein of the reproductive axis with diverse action in cell recognition and differentiation. Endocrin. Reviews, 2002, 23 (4): 401-430), фолликулярной – гликоделин-F (Chiu P.C., Koistinen R., Koistinen H. et al. Zona binding inhibitory factor-1 from human follicular fluid is an isoform of glycodelin. Biol. Reprod., 2003, 69: 365-372), кумулюсной – гликоделин-С (Chiu P.C., Chung M.K., Koistinen R. et al. Cumulus oophorus-associated glycodelin-C displaces sperm bound glycodelin-A and – F and stimulates spermatozoa-zona pellucida binding. J. Biol. Chem., 2007, 282 (8): 5378-88). Уровень АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях отражает функциональное состояние органов репродуктивной системы человека, его количественное определение может быть использовано для дифференциальной диагностики и контроля эффективности лечения нарушений репродуктивного здоровья.

Изобретение относится к гибридомной биотехнологии и может быть использовано для создания иммунодиагностических тест-систем с целью количественного определения АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях.

Цель изобретения – получение штамма гибридомных клеток, синтезирующих МКА против АМГФ/гликоделина с высокой пролиферативной активностью и продуктивностью. В зарубежной литературе описано получение МКА к белкам РР14 (Riitinen L., Narvanen О., Virtanen et al. Monoclonal antibodies against endometrial protein PP 14 and their use for purification and radioimmunoassay ofPP 14. J. Immunol. Methods, 1991, 136: 85-90), 2-PEG (Bell S.C., Jackson J., Dore-Green F. et al. Development and validation of a radioimmunoassay for human 2-PEG and detection in serum during pregnancy Hum. Reprod., 1987, 25 (5): 389-97), гликоделину (Eschke U., Kuhn С., Mylonas I. et al. Development and characterization of monoclonal antibodies for the immunohistochemical detection of glycodelin A in decidual, endometrial and gynecological tumor tissues. Histopathology, 2006, 48 (4):394-406). Однако при получении штаммов гибридных клеток были использованы другой источник антигена для иммунизации (очищенный цитозольный экстракт эндометрия – (Bell S.C., Jackson J., Dore-Green F. et al. Development and validation of a radioimmunoassay for human 2-PEG and detection in serum during pregnancy Hum. Reprod., 1987, 25 (5): 389-97); другой способ иммунизации (подкожное введение) и партнеры для гибридизации – спленоциты и миелома линии X63-Ag8.653 (Riitinen L., Narvanen 0., Virtanen et al. Monoclonal antibodies against endometrial protein PP 14 and their use for purification and radioimmunoassay of PP 14. J. Immunol. Methods, 1991, 136: 85-90); полученные МКА были направлены к углеводным структурам гликоделина и реагировали только с белком, выделенным из амниотической жидкости, но не со спермальным гликоделином (Eschke U., Kuhn С., Mylonas I. et al. Development and characterization of monoclonal antibodies for the immunohistochemical detection of glycodelin A in decidual, endometrial and gynecological tumor tissues. Histopathology, 2006, 48 (4):394-406), поэтому тождества с аналогами не имеется.

Отечественные штаммы гибридом, продуцирующие МКА, реагирующие с разными гликоформами АМГФ/гликоделина, получены нами впервые.

За прототип принят штамм гибридомных клеток 3с12 (Болтовская М.Н., Старосветская Н.А., Маршицкая М.И., Назимова С. В., Степанов А.А., Шевченко В.В. Получение и практическое использование моноклональных антител против альфа2-микроглобулина фертильности. Бюлл. эсперим. биол. и мед. – 1997. – Т.124, 9. – С.319-322), продуцирующий МКА IgGl класса, направленное против одного из эпитопов молекулы АМГФ, выявляющее данный белок в твердофазном иммуноферментном анализе с чувствительностью до 5 нг/мл. В отличие от прототипа, полученного при гибридизации лимфоцитов селезенки мышей Balb/c, иммунизированных 4-кратным внутрибрюшинным введением 10 мкг АМГФ, выделенного из амниотической жидкости, с завершающей внутривенной иммунизацией, штамм гибридомы А-4А7 был получен с использованием другого способа иммунизации, чувствительность выявления АМГФ в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с использованием МКА А-4А7 составляет 1 нг/мл.

Штамм А-4А7 получают следующим способом.

Мышей Balb/c иммунизируют 4-х кратным введением 10-40 мкг АМГФ (последовательно в полном, неполном адъюванте Фрейнда и в физиологическом растворе) в подушечки лап. Спустя 3 дня после заключительной иммунизации лимфоциты подколенных лимфоузлов гибридизируют с клетками сингенной миеломы линии Sp2/0.Agl4 в соотношении 1:10 в 50% растворе полиэтиленгликоля-4000 (Merck) с 10% диметилсульфоксида в среде RPMI 1640 в течение 1 мин. После гибридизации клетки ресуспендируют в селективной среде HAT – гипоксантин, аминоптерин, тимидин (Flow) на основе RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки (Flow) и 4 мМ глутамина и рассевают в культуральные 96-луночные плоскодонные микропланшеты (Costar, Linbro). Спустя три недели после гибридизации (завершение этапа метаболической селекции) первичные гибридомы и/или клоны переводят на среду НТ, не содержащую аминоптерин, а через неделю культивирования исключают НТ. Через 7-14 дней после гибридизации в лунках наблюдают рост колоний гибридных клеток.

Для селекции гибридом, продуцирующих МКА заданной специфичности, из лунок с растущими колониями отбирают культуральный супернатант и тестируют его методом твердофазного ИФА в варианте, исключающем возможность отбора МКА на конформационно-измененный антиген. Для этого микропланшеты для ИФА сенсибилизируют аффинно-очищенными поликлональными кроличьими антителами против IgG мыши в концентрации 2 мкг/мл в карбонат-бикарбонатном буфере (0.05М, рН 9.5), неспецифическое связывание блокируют 1%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере рН 7.4. Затем в лунки вносят по 100 мкл тестируемых образцов культурального супернатанта и инкубируют 1 ч при комнатной температуре на шейкере. В качестве детектора используют конъюгат высокоочищенного АМГФ с пероксидазой хрена в разведении 1:1000, полученный в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ МЧ РАМН (инкубация 1 ч при комнатной температуре на шейкере). После каждой инкубации микропланшеты 5-кратно отмывают от несвязавшихся компонентов. Реакцию проявляют 4 мМ тетраметилбензидин дигидрохлорида с 0.01% перекисью водорода в 100 мМ фосфатно-цитратном буфере рН 4.5 (20 мин в темноте при комнатной температуре) и останавливают однонормальной серной кислотой. Оптическую плотность регистрируют с помощью сканирующего многоканального спектрофотометра Multiskan Titertek (Flow, UK) при длине волны 450 нм.

Гибридомы, в супернатанте которых обнаружены МКА против АМГФ, клонируют методом предельных разведений в жидкой фазе на фидерном слое тимоцитов 2-4 раза, пока частота позитивных клонов не достигнет 100%. АМГФ-позитивные клоны наращивают в 24-луночных культуральных планшетах, отбирая супернатант для оценки специфичности продуцируемых МКА. Специфичность МКА определяют методом непрямого ИФА с использованием очищенных препаратов эндометриальных и плацентарных белков (плацентарный 1-микроглобулин, трофобластический 1-глобулин, хорионический гонадотропин), -фетопротеина, сывороточного альбумина человека, С-реактивного белка, сорбированных на твердой фазе из растворов с концентрацией 1 мкг/мл. Клоны, реагирующие с АМГФ и не дающие перекрестных реакций с контрольными белками, размножают in vitro и in vivo.

Штамм А-4А7 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные свойства штамма: гибридные клетки растут в виде суспензии in vitro или в виде асцитно-солидной опухоли в перитонеальной полости после введения сингенным мышам Balb/c.

Условия культивирования штамма in vitro: среда RPMI 1640, 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, температура 37°С, газовая фаза 5-7% СО₂, стеклянные или пластиковые флаконы. Концентрация клеток при посеве 2×10⁵ /мл, кратность пассирования – 2-3 раза в неделю, предельная плотность – 10⁶/мл. Штамм перевивают на среде, не содержащей антибиотики. Контаминация бактериями и грибами не обнаруживается.

Культивирование в организме животного: мыши Balb/c, предобработанные вазелиновым маслом (0,5 мл внутрибрюшинно за 10-30 дней до введения гибридных клеток), доза вводимых клеток 2-5×10⁶/мышь, время образования асцита 7-14 дней, объем асцитной жидкости 3-7 мл.

Титры моноклональных антител при определении методом твердофазного иммуноферментного анализа 1:500-1:1000 в культуральных супернатантах, 1:10⁶-1:10⁷ в асцитной жидкости.

Рекомендуемые условия для замораживания. Клетки суспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида, разводят до концентрации 1-2×10⁶ клеток/мл и переносят в пластиковые криовиалы. Виалы в толстостенном пенопластовом контейнере помещают на ночь в низкотемпературный холодильник (-70°С), после чего переносят в жидкий азот.

Производимый штаммом А-4А7 продукт – моноклональные антитела. Маркерный признак – продукция МКА против АМГФ/гликоделина человека.

Активность (продуктивность) штамма: гибридомный культуральный супернатант содержит 3-5 мкг/мл МКА, асцитная жидкость – 2-5 мг/мл МКА. Способ определения активности штамма – спектрофотометрическое определение концентрации иммуноглобулинов в культуральной среде и асцитной жидкости, определение титра МКА в ИФА с антигеном, сорбированным на твердой фазе.

МКА, продуцируемые штаммом А-4А7, относятся к классу иммуноглобулинов IgGI по данным ИФА с типирующими моноспецифическими антисыворотками против классов иммуноглобулинов мыши.

Кариотип гибридных клеток штамма – мышиный, модальное число хромосом не определялось.

Область применения штамма А-4А7: биотехнология, репродуктивная медицина.

Примеры использования штамма гибридных клеток (гибридомы)

Пример 1. Использование МКА, продуцируемых штаммом А- 4А7, для создания иммуноферментной тест-системы для количественного определения АМГФ/гликоделина.

Для масштабной наработки МКА штамм гибридных клеток А-4А7 культивируют в сингенных мышах Balb/c и получают асцитную жидкость. Из асцитной жидкости МКА А-4А7 выделяют высаливанием 50%-ным сульфатом аммония с последующей очисткой методом ионообменной хроматографии на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой. Для использования в качестве детектирующего антитела МКА А-4А7 конъюгируют с пероксидазой корня хрена по методу Nakane и тестируют с разведениями (от 100 до 1 нг/мл) стандарта антигена (АМГФ/гликоделин, выделенный из амниотической жидкости), внесенными в лунки 96-луночных плоскодонных микропланшетов с иммобилизованными на твердой фазе МКА против другого эпитопа молекулы АМГФ/гликоделина («ловушечными» МКА). Реакцию проявляют 4 мМ тетраметилбензидиндигидрохлорида с 0.01% перекисью водорода в 100 мМ фосфатно-цитратном буфере рН 4.5 (20 мин в темноте при комнатной температуре) и останавливают однонормальной серной кислотой. Оптическую плотность регистрируют с помощью сканирующего многоканального спектрофотометра Multiskan Titertek (Flow, UK) при длине волны 450 нм.

Использование МКА А-4А7 в качестве детектирующих антител в сэндвич-варианте ИФА вместо прототипа МКА 3с12 повысило чувствительность выявления АМГФ до 1нг/мл.

Количественная характеристика разработанной тест-системы включает определение воспроизводимости параметров по калибровочной кривой и постановку тестов на надежность, точность и специфичность.

Воспроизводимость стандартной кривой. Средняя концентрация пробы, определяемая на середине участка калибровочной кривой, соответствовала истинной концентрации АМГФ с коэффициентом вариации 8%.

Контроль надежности. Коэффициент вариации «теста на открытие» составлял 10%, «теста на параллелизм» – 9%.

Контроль точности. При определении концентрации АМГФ в нескольких репликах одновременно для вариантов контрольной сыворотки с низким, средним и высоким содержанием АМГФ коэффициент вариации для каждой пробы не превышал 10%.

Контроль специфичности. При использовании разработанной тест-системы не обнаружено перекрестных реакций с -фетопротеином, плацентарным 1-микроглобулином, С-реактивным белком, сывороточным альбумином человека, трофобластическим 1-глобулином, фолликулостимулирующим и лютеинизирующим гормонами, хорионическим гонадотропином человека.

Пример 2. Использование МКА А-4А7 для иммуноферментного анализа концентрации АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях.

Для определения концентрации АМГФ в биологических жидкостях в лунки, сенсибилизированные «ловушечными» МКА, вносят стандарты антигена и тестируемые образцы биологических жидкостей (амниотическая жидкость, фолликулярная жидкость и сыворотка крови женщин, семенная жидкость мужчин) и инкубируют 1 час при комнатной температуре. После трехкратной отмывки планшетов в лунки добавляют МКА А-4А7, конъюгированные с пероксидазой корня хрена, в разведении 1:1000 (инкубация 1 ч при комнатной температуре). После 5-кратного отмывания лунок микропланшетов от несвязавшихся компонентов реакцию проявляют 4 мМ тетраметилбензидиндигидрохлорида с 0.01% перекисью водорода в 100 мМ фосфатно-цитратном буфере рН 4.5 (20 мин в темноте при комнатной температуре) и останавливают однонормальной серной кислотой. Оптическую плотность регистрируют с помощью сканирующего многоканального спектрофотометра Multiskan Titertek (Flow, UK) при длине волны 450 нм.

При внесении в тест-систему фолликулярной жидкости, амниотической жидкости и сыворотки крови женщин, семенной жидкости мужчин детектирующие МКА А-4А7, полученные в результате иммунизации белком, выделенным из амниотической жидкости, связываются с АМГФ, присутствующим во всех исследованных биологических жидкостях, давая положительную реакцию в иммуноферментном анализе. Это указывает на то, что МКА А-4А7 реагируют не с углеводной частью молекулы гликоделина, различной для его изоформ, а с общей для всех изформ белковой частью молекулы. Следовательно, МКА А-4А7 могут быть использованы для иммунодетекции различных гликоформ АМГФ/гликоделина (амниотической, спермальной, фолликулярной), продуцируемых в тканях женской и мужской репродуктивной системы.

При исследовании 200 образцов семенной плазмы, 25 образцов амниотической жидкости и сыворотки крови женщин (второй триместр беременности), 79 образцов фолликулярной жидкости выявлена широкая индивидуальная вариабельность показателей АМГФ в биологических средах. Диапазон концентраций АМГФ в семенной жидкости составляет 4-400 мкг/мл, в амниотической жидкости 3-54 мкг/мл, в сыворотке крови женщин 90-840 нг/мл, в фолликулярной жидкости 1-14 нг/мл.

Таким образом, МКА А-4А7 в отличие от известных ранее реагируют по крайней мере с тремя гликоформами гликоделина – амниотической, спермальной и фолликулярной, обеспечивая возможность создания специфичных и высокочувствительных иммуноферментных тест-систем для количественного определения различных изоформ гликоделина в биологических жидкостях.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. A-4A7 – продуцент моноклональных антител, реагирующих с амниотической, спермальной и фолликулярной гликоформами альфа2 – микроглобулина фертильности (АМГФ)/гликоделина и используемых для создания иммуноферментных тест-систем для количественного определения гликоформ АМГФ/гликоделина в биологических жидкостях, депонированный в коллекции перевиваемых культур клеток млекопитающих ГУ НИИ морфологии человека РАМН под 131/2002.