Патент на изобретение №2360255

(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЯЖЕСТИ ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ У ДЕТЕЙ

(57) Реферат:

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам, и может быть использовано для мониторинга тяжести инфекционного мононуклеоза (ИМ), вызванного вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ), цитомегаловирусом (ЦМВ) на ранних сроках. Для осуществления способа проводят оценку иммунологических параметров, а именно уровней цитокинов: интерлейкин-2, интерлейкин-6, интерлейкин-8 на ранних сроках заболевания (с 1 по 3 день болезни) и в период ранней реконваленсценции (с 14 по 16 день болезни). На основании этих параметров прогнозируют среднетяжелую и тяжелую формы инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ Илии ЦМВ. Использование изобретения позволяет своевременно корректировать терапию больных уже на ранних сроках болезни и, опираясь на конкретные иммунологические показатели, применить иммуномодулирующие препараты и предотвратить развитие тяжелого течения заболевания. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины, разделу детских инфекционных болезней, а именно диагностике различных форм инфекционного мононуклеоза, раннему прогнозированию тяжести заболевания, что позволяет назначить адекватную терапию для профилактики тяжелых форм заболевания и профилактики осложнений.

На сегодняшний день по данным большинства исследователей более 90% населения Земного шара инфицировано вирусом из семейства Herpesveridea. При этом у половины из них инфицирование сопровождается клиническими и гематологическими проявлениями мононуклеоза. Также доказано, что инфекционный мононуклеоз способен вызывать не только ВЭБ, как это считалось раньше, но и цитомегаловирус.

Следует отметить, что инфекционный мононуклеоз – это острое лимфопролиферативное заболевание доброкачественного характера, сопровождающееся иногда серьезными неврологическими осложнениями: энцефалит, параличи черепных нервов, в том числе паралич Белла или прозопоплегия (паралич мимической мускулатуры, обусловленный поражением лицевого нерва), менингоэнцефалит, синдром Гийена-Барре, полиневрит, поперечный миелит. Может развиться гепатит, а также кардиологические осложнения (перикардит, миокардит). Со стороны органов дыхания иногда наблюдается интерстициальная пневмония и обструкция дыхательных путей. К гематологическим осложнениям относится аутоиммунная гемолитическая анемия, тромбоцитопения и гранулоцитопения.

На современном этапе «золотым стандартом» для диагностики возбудителя инфекционного мононуклеоза с определением стадии инфекционного процесса считается метод иммуноферментного анализа (ИФА). Особенностью гуморального иммунного ответа человека на герпесвирусную инфекцию является дифференцированная во времени наработка иммуноглобулинов классов G и М на различные вирусные белки [1]. Метод ИФА, оставаясь «золотым стандартом» определения возбудителя инфекционного мононуклеоза и стадии заболевания, все таки является методикой с определенными недостатками: нередко имеют место перекрестные реакции с другими герпесвирусами, обусловленные гомологией ряда белков семейства герпесвирусов [2], и к тому же не определяет тяжесть заболевания.

Таким образом, возможности ИФА ограничены тем, что данный метод не указывает на тяжесть инфекционного процесса и степень поражения иммунной системы при инфекционном мононуклеозе.

Известны клинико-иммунологические, серологические критерии, по которым определяется развитие тяжелого инфекционного мононуклеоза, вызванного ВЭБ-инфекцией [5]. Однако ни один из этих методов не включал в себя цитомегаловирусный мононуклеоз. Механизмы формирования тяжести инфекции остаются плохо прогнозируемыми.

Все вышеизложенное обосновывает необходимость разработки и внедрения более доступных к широкому применению и простых в использовании методов определения тяжести инфекционного мононуклеоза, что позволит своевременно корректировать терапию больных уже на ранних сроках болезни, грамотно, опираясь на конкретные иммунологические показатели, применить иммуномодулирующие препараты и тем самым предотвратить развитие тяжелого течения заболевания.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ прогнозирования тяжелого затяжного течения инфекционного мононуклеоза у детей, приведенный в работе Родионовой О.В. и Букиной А.А. “Клинико-этиологические аспекты и новые подходы к терапии инфекционного мононуклеоза у детей”. Так, по данным этих авторов, в ранние сроки прогностически значимыми являются размеры гепато- и спленомегалии, концентрация специфических иммунных комплексов с превалированием антигена (ИКАГ), количество атипичных мононуклеаров, концентрация -интерферона, активность лимфоцитов в реакция бласттрансформации лимфоцитов на фитогемаглютинин (РБТЛ на ФГА). С учетом коэффициента каждого параметра высчитывался суммарный балл, по величине которого прогнозировали тяжесть течения ИМ. Однако недостатком данного способа является сложность разработанного алгоритма, включающего большое количество параметров, необходимость использовать 4 варианта количественной РСК (реакции связывания комплемента), основанной на количественном учете показателя лизиса эритроцитов барана. Метод неприменим на практике из-за сложности, длительности и трудоемкости выполнения [5].

Следовательно, он не может эффективно использоваться для прогноза инфекционного мононуклеоза. Указанные недостатки существенно ограничивают возможность раннего и точного прогноза течения инфекционного мононуклеоза, критерии не показывают изменений такого важного звена иммунитета как система цитокинов, отражающая соотношение клонов Th1 и Th2 типов, а именно нарушения Т-клеточного ответа определяют развитие неблагоприятного течения заболевания.

Известен «Способ диагностики тяжелых форм инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр у детей» Аксенова О.А., Букина А.А., Родионова О.В. (патент на изобретение 2172956 от 27.08.2001 г.), который включает в себя определение специфических иммунных комплексов с данным ДНК-содержащим вирусом по увеличению активности экзогенного комплемента при одновременном внесении его в реакцию со специфическими антителами (СИК-1) или вирусом Эпштейна-Барра (СИК-2) с дальнейшим расчетом активности иммунных комплексов по формуле и дифференцировку тяжелых форм от легких по наличию в крови специфических иммунных комплексов по коэффициенту СИК-1 или СИК-2.

Ближайшим аналогом является «Способ прогнозирования течения инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, у детей», предложенный Левиной А.С., Ивановой В.В., Железниковой Г.Ф., Монаховой Е.Н. (патент на изобретение 2285262 от 20.04.2005 г.). По данным авторов на ранних сроках заболевания прогностически значимым является уровень цитокинов: интерферон-гамма, фактор некроза опухоли-альфа, интерлейкин-4. Однако на его основании прогнозируют развитие у детей рецидивирующего течения инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр.

Общим недостатком этих методов является их направленность на одного возбудителя инфекционного мононуклеоза, а именно вируса Эпштейна-Барр, невозможность эффективного использования для прогноза тяжелой формы инфекционного мононуклеоза. Все изложенное выше демонстрирует необходимость дальнейшего поиска методов диагностики тяжести инфекционного мононуклеоза.

В настоящее время признано, что иммунные нарушения при инфекционном мононуклеозе носят комбинированный характер, они касаются как клеточного, так и гуморального звена, влекут за собой утяжеления, учащение осложнений, возможность развития негладкого течения, рецидивов болезни, что отражает суть инфекционного мононуклеоза как заболевания иммунной системы [3, 4]. Следовательно, для развития эффективной иммунной защиты при ИМ имеет принципиальное значение определение типа ответа: Th1 – реакции клеточного иммунитета или Th2 – реакции гуморального иммунитета.

Задача изобретения – разработка эффективного способа раннего прогнозирования тяжести различных форм инфекционного мононуклеоза, с использованием показателей цитокинов сыворотки крови.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении доступности и точности прогноза тяжести инфекционного мононуклеоза у детей в зависимости от возбудителя на ранних сроках болезни, что важно для своевременного назначения противовирусной и иммуномодулирующей терапии и определения длительности ее применения.

Заявленный способ прогнозирования тяжести инфекционного мононуклеоза с использованием сывороточных цитокинов имеет следующие общие признаки с прототипом:

1. Методика забора исследуемого материала кровь из локтевой вены не более 3-5 мл двукратно).

2. Позволяет определить тип иммунного ответа при инфекционном мононуклеозе.

Отличительными от прототипа признаками заявляемого способа являются:

1. Определение содержания цитокинов сыворотки крови – ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, направленных на разные звенья иммунного ответа.

2. Прямая взаимосвязь сывороточных цитокинов с тяжестью заболевания.

3. Определение сывороточных цитокинов у больных инфекционным мононуклеозом разной этиологии.

При анализе имеющейся научной и патентной информации не обнаружено сведений, относящихся к использованию определения содержания уровня сывороточных цитокинов с учетом их корреляции для прогнозирования тяжести инфекционного мононуклеоза.

Объектом исследования были 32 пациента с инфекционным мононуклеозом; из них 18 пациентов с инфекционным мононуклеозом, вызванным вирусом Эпштейна-Барр, 14 пациентов с цитомегаловирусным мононуклеозом. Группу контроля составили 10 детей.

Способ осуществляется следующим образом: с помощью метода сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем производства Санкт-Петербургской фирмы ООО «Цитокин» определяли в сыворотке крови больного комплекс цитокинов – ИЛ-2, ИЛ-6 и ИЛ-8.

При получении следующих показателей при первом обследовании (с 1 по 3 день болезни) при ИЛ-6 ниже 160 пг/мл, ИЛ-8 ниже 200 пг/мл, ИЛ-2 ниже 20 пг/мл прогнозируют среднетяжелую форму инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, при ИЛ-6 ниже 90 пг/мл, ИЛ-8 ниже 60 пг/мл, ИЛ-2 ниже 35 пг/мл прогнозируют среднетяжелую форму инфекционного мононуклеоза, вызванного цитомегаловирусом, тяжелую форму инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, прогнозируют при уровне сывороточных цитокинов в начале заболевания (с 1 по 3 день болезни) ИЛ-6 выше 1075 пг/мл, ИЛ-8 выше 910 пг/мл, ИЛ-2 выше 70 пг/мл.

Способ можно проиллюстрировать на конкретных примерах.

Пример 1.

Больная Л., 5 лет, история болезни 1355. Предварительный диагноз – Инфекционный мононуклеоз.

Поступила в ГКБ 2 в ДИО 2 на 2 день болезни с жалобами на повышение температуры тела до 38,0°С, вялость, затрудненное носовое дыхание, храп во сне, увеличение шейных лимфатических узлов. При поступлении состояние средней тяжести за счет симптомов интоксикации, температура тела 38,3°С, носовое дыхание затруднено, в зеве яркая разлитая гиперемия, миндалины гипертрофированны до 2-3 степени, на обеих миндалинах обильные белые налеты. Пальпируются задне- и переднешейные лимфоузлы до 2,0 см, в виде «пакетов», умеренно-болезненные, не спаянные с окружающими тканями. Печень пальпируется на 2,5 см ниже реберной дуги. Селезенка+2,5 см. В клиническом анализе крови: лейкоцитоз 27,9×10⁹/л, атипичных мононуклеаров 18%, СОЭ – 9 мм/час.

В крови выявлены маркеры ВЭБ инфекции: anti-VEB-VCA IgM. Методом ПЦР обнаружено ДНК ВЭБ. Антитела к цитомегаловирусу не обнаружены. ДНК цитомегаловируса методом ПЦР не обнаружена.

Исследование цитокинового спектра:

1-3 день болезни: ИЛ-2 -18 пг/мл, ИЛ-6 – 119 пг/мл, ИЛ-8 – 168 пг/мл.

14-16 день болезни: ИЛ-2 – 38 пг/мл, ИЛ-6 – 10 пг/мл, ИЛ-8 – 32 пг/мл.

Окончательный диагноз: Инфекционный мононуклеоз, типичный, среднетяжелое течение.

Пример 2.

Больная Д., 6 лет, история болезни 1184. Предварительный диагноз: ОРВИ. Шейный лимфаденит. Аллергическая сыпь.

Поступил в ГКБ 2 в ДИО 2 в первые сутки заболевания с жалобами на повышение температуры тела до 38,5°С, вялость, затрудненное носовое дыхание, боль в горле при глотании, кашель, увеличение шейных лимфатических узлов.

При поступлении состояние средней тяжести за счет симптомов интоксикации. Кожные покровы розовые, на теле и конечностях ярко-розовая пятнисто-папулезная сыть аллергического характера. Носовое дыхание затруднено, отделяемое скудное слизистое. В зеве яркая разлитая гиперемия, миндалины гипертрофированны до 3 степени, гнойных налетов нет. Пальпируются заднее- и переднешейные лимфоузлы до 2,0 см, в виде «пакетов», безболезненные, не спаянные с окружающими тканями. Печень на 2,0 см ниже края реберной дуги. Селезенка увеличена на 1,5 см.

В клиническом анализе крови: лейкоцитоз 17,3×10⁹/л, атипичных мононуклеаров 10%, СОЭ – 8 мм/час.

В крови выявлены маркеры: цитомегаловирусной инфекции: anti-CMV IgM

Методом ПЦР: ДНК ЦМВ не обнаружено.

Исследование цитокинового спектра:

1-3 день болезни: ИЛ-2 – 31 пг/мл, ИЛ-6 – 81 пг/мл, ИЛ-8 – 53 пг/мл.

14-16 день болезни: ИЛ-2 – 53 пг/мл, ИЛ-6 – 25 пг/мл, ИЛ-8 – 20 пг/мл.

Окончательный диагноз: Инфекционный мононуклеоз цитомегаловирусной этиологии, среднетяжелое течение.

Пример 3.

Больной И., 5 лет, история болезни 1386. Предварительный диагноз: Инфекционный мононуклеоз.

Поступил в ГКБ 2 в ДИО 2 в первые сутки заболевания с жалобами на повышение температуры тела до 41,0°С, вялость, затрудненное носовое дыхание, «храпящее» ночью, боль в горле при глотании, осиплость голоса, увеличение шейных и подчелюстных лимфатических узлов, абдоминальные боли.

При поступлении состояние тяжелое за счет симптомов интоксикации, выраженного лимфопролиферативного синдрома. Кожные покровы бледные, чистые, лицо одутловатое, пастозность век. Носовое дыхание затруднено, отделяемое скудное, слизистое, «храпящее» ночью. В зеве яркая разлитая гиперемия, миндалины гипертрофированны до 3-4 степени, на обеих миндалинах обильные гнойные налеты. Пальпируются задне- и переднешейные лимфоузлы до 3,5 см, виде «пакетов» подчелюстные до 4,5 см, единичные, умеренно-болезненные, не спаянные с окружающими тканями. Печень на 5,0 см ниже края реберной дуги, выраженный болевой синдром из-за перерастяжения капсулы печени. Селезенка увеличена на 3,0 см.

В клиническом анализе крови: лейкоцитоз 29,0×10⁹/л, атипичных мононуклеаров 65%, СОЭ – 42 мм/час.

В крови выявлены маркеры: ВЭБ-инфекции: anti-VEB-VCA IgM, anti-VEB-NA IgG. Методом ПЦР обнаружено ДНК ВЭБ.

Исследование цитокинового спектра:

1-3 день болезни: ИЛ-2 – 74 пг/мл, ИЛ-6 – 860 пг/мл, ИЛ-8 – 975 пг/мл.

14-16 день болезни: ИЛ-2 – 23 пг/мл, ИЛ-6 – 6 пг/мл, ИЛ-8 – 235 пг/мл.

Окончательный диагноз: Инфекционный мононуклеоз, типичный, тяжелое течение.

Настоящий способ прогнозирования течения инфекционного мононуклеоза различной этиологии у детей позволяет предположить развитие тяжелого течения болезни, вовремя провести адекватную противовирусную и иммуномодулирующую терапию и может использоваться в работе инфекционных отделений детских больниц.

Литература

4(18).

1.

4. Кельцев В.А. Состояние иммунной системы у детей с инфекционным мононуклеозом и обоснованием иммунокоррегируюей терапии / Детские инфекции. – 2004. – 3. – С.15-20.

5. Родионова О.В. Клинико-этиологические аспекты и новые подходы к терапии инфекционного мононуклеоза у детей. – СПб., 2000.

Таблица 1
Уровень сывороточных цитокинов у детей, больных инфекционным мононуклеозом различной этиологии в острый период заболевания и период реконвалесценции (пг/мл)
Цито- кины	Сроки заболевания	Контроль- ная группа (n=10)	Больные инфекционным мононуклеозом различной этиологии	Достоверность различий
средней степени тяжести	тяжелой степени тяжести
ВЭБ (n=16)	ЦМВ (n=14)	ВЭБ (n=3)
1	2	3
IL-2	Острый	33,0±2,0	28,0±4,3*	31,7±3,4	70,3±6,9	P1-3<0,05
Р2-3<0,001
Реконвалесценции	46.9±7.6*	53,5±12,0**	29,3±5,5	Р1-3<0,05
P2-3<0,001
Р	<0,01	<0,01	<0,01
IL-6	Острый	8,4±0,7	112,7±19,6***	63,6±11,9***	908,7±74,2	P1-3<0,05
Р2-3<0,001
Реконвалесценции	10,3±1,1*	27,8±4,1**	6,1±0,2	P1-3<0,05
Р2-3<0,01
Р	<0,001	<0,001	<0,001
IL-8	Острый	19,0±0,8	163,9±20,0***	52,6±2,5***	1075,0±116,7	P1-3<0,001
Р2-3<0,001
Реконвалесценции	37,9±4,7**	20,7±2,8	246,0±32,0	P1-3<0,05
Р2-3<0,001
Р	<0,001	<0,001	<0,001
Примечание: достоверно в сравнении с контрольной группой * – р<0,05; ** – р<0,01; *** – р<0,001;

Формула изобретения

Способ прогнозирования тяжести инфекционного мононуклеоза различной этиологии у детей, включающий оценку иммунологических параметров методом иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что на ранних сроках заболевания определяют уровень сывороточных цитокинов: интерлейкин-2, интерлейкин-6, интерлейкин-8, устанавливают уровни этих цитокинов: в период начала заболевания (с 1-го по 3-й день болезни) при интерлейкин-6 ниже 160 пг/мл, интерлейкин-8 ниже 200 пг/мл и интерлейкин-2 ниже 20 пг/мл прогнозируют среднетяжелую форму инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, при значении интерлейкин-6 ниже 90 пг/мл, интерлейкин-8 ниже 60 пг/мл, интерлейкин-2 ниже 35 пг/мл прогнозируют среднетяжелую форму инфекционного мононуклеоза, вызванного цитомегаловирусом, а в период ранней реконвалесценции (с 14-го по 16-й день болезни) при инфекционном мононуклеозе, вызванном вирусом Эпштейна-Барр, интерлейкин-6 определяют ниже 15 пг/мл, интерлейкин-8 – ниже 50 пг/мл, интерлейкин-2 – ниже 90 пг/мл, при значениях интерлейкин-6 ниже 30 пг/мл, интерлейкин-8 ниже 30 пг/мл интерлейкин-2 ниже 90 пг/мл прогнозируют среднетяжелую форму инфекционного мононуклеоза, вызванного цитомегаловирусом, тяжелую форму инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом Эпштейна-Барр, прогнозируют в начале заболевания (с 1-го по 3-й день болезни) при интерлейкин-6 выше 1075 пг/мл, интерлейкин-8 выше 910 пг/мл, интерлейкин-2 выше 70 пг/мл.